Name: generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00
Duration: 16 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides at JoVE.com

Эта работа была поддержана коалицией Грузии рака грант-R9028.

<ol>
	<li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+DNA+repair.">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li><li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast.">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li><li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair.">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li><li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+H:+the+enzymes+in+eukaryotes.">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li></ol>

Видео-продукции для этой статьи была организована Thermo Fisher Scientific, которая производит реактивы и инструмент, используемые в настоящей публикации.

Тот факт, что РНК может передавать генетическую информацию непосредственно геномной ДНК в клетках было обнаружено использование использование синтетических РНК-содержащих олигонуклеотидов (Dharmacon синтезированных олигонуклеотидов) 1. Это было доказательством принципа, что клетки могут использовать РНК-содержащих молекул или РНК-последовательностей, только в качестве шаблонов для синтеза ДНК. Использовать РНК-содержащих олигонуклеотидов не только привело к демонстрации того, что генетическая информация может быть передана непосредственно от РНК к геномной ДНК без необходимости обратной транскрипции ДНК-копию промежуточного, но и доказательство того, что РНК может быть использован в качестве шаблона в гомологичных ремонт повреждений ДНК 1,3. Олигонуклеотидов могут быть изготовлены из РНК-содержащие или содержащие только одно рибонуклеотид встроенные в ДНК последовательности, как в примере, мы представили здесь. РНК-содержащих олиго имеет один встроенный рибонуклеотид направленных на корректировку нонсенс-мутации в геномной дефектных trp5 аллеля. Передачи генетической информации от рибонуклеотид в геномной ДНК проявляется изменением фенотипа (клетка, растущих на среде отсутствует триптофан) из клеток-мишеней. Частота гена коррекции, полученные с РНК-содержащих олиго измеряется и по сравнению с контролем ДНК-только олиго. Выполняя этот анализ генов коррекции в разных слоев клетки, где мы мутировать различных генов дрожжей, мы можем обнаружить, какой фактор / с затрагивающих таргетинг по РНК-содержащих олигонуклеотидов. Таким образом, мы можем выявить механизмы, как клетки регулируют стабильность РНК / ДНК гибридов. Просто проектирования различных вариантов РНК-содержащих олигонуклеотидов можно определить вероятность для конкретного тракта РНК в качестве шаблона в ДНК, модификации и мы можем определить устойчивость специфические последовательности РНК, встроенные в ДНК. Более того, мы можем определить, что является предпочтительным в естественных субстратов для факторов, взаимодействующих с РНК / ДНК гибридов. Хотя некоторые лабораторные исследования, в основном используя короткие РНК-содержащих олигонуклеотидов, были проведены, чтобы охарактеризовать функции факторов, которые могут распознать РНК гибрид с ДНК, например, ферментов РНКазы H 4, в естественных функций РНКазы H, а как личность других белков, которые могут повлиять РНК / ДНК гибридных стабильности остаются по большей части неизвестна. Возможность использовать РНК-содержащих олигонуклеотидов значительной длины (от 50 до 80-меров) и оптимального качества (например, Thermo Scientific Dharmacon РНК-содержащих олигонуклеотидов) имеет открыть путь к изучению широкого спектра молекулярных процессов непосредственно в естественных условиях в Клетки интерес. Как показано в этом видео, преобразование с помощью РНК-содержащих олигонуклеотидов требует по существу, лишь несколько дополнительных шагов по сравнению с преобразованием при помощи ДНК-молекул, в целях предотвращения деградации РНКазы. Таким образом, преобразование с помощью РНК-содержащих олигонуклеотидов не ограничивается дрожжей системы, но может быть применен к любой организм или тип клеток, где трансформация ДНК-олигонуклеотиды владеет. В заключение ориентации клеток РНК-содержащих олигонуклеотидов дает возможность получать РНК / ДНК гибридов и рибонуклеотидов встроенные в ДНК в естественных условиях в клетках. Стабильность, функции и последствия этих порожденных в естественных условиях РНК / ДНК гибриды могут быть проанализированы и характеризуется, потенциально раскрытие неизвестных механизмов репарации ДНК и выявление новых стратегий для генного таргетинга.

А. Преобразование реагентов и средств массовой информации (с изменениями от Storici и Резник, 2006 <ol><li> YPD (дрожжевой пептон декстроза): на 1 л, 10 г дрожжевого экстракта, 20 г соевого пептона, 20 г декстрозы. Добавьте 15 г агара, чтобы сделать YPD твердых средах. Автоклав перед использованием. Хранить при комнатной температуре. </li><li> Решение 1: 0,1 М ацетата лития. Подготовка непосредственно перед преобразованием. Раствор 1 рабочего раствора, таким образом, она готова прямо из порошка. Нет маточного раствора производится. Хранить при комнатной температуре. LiAc увеличивает стене дрожжевых клеток проницаемости для ДНК. </li><li> Решение 2: 0,1 М ацетата лития и 50% полиэтиленгликоля 4000. Кроме того, решение 2 является рабочим раствором и это сделано непосредственно из порошка. Нет маточный раствор готов. Хранить при комнатной температуре. PEG месторождений олигонуклеотидов на дрожжевых клеток. </li><li> РНК-содержащих олигонуклеотидов (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-меров, обессоленной, снимают защиту и не очищается. Ресуспендируют до 250 пмоль / мкл. Хранить при температуре -80 ° C. </li><li> ДНК-только олигонуклеотидов, 50-80-меров, обессоленной и неочищенные. Ресуспендируют до 50 пмоль / мкл. Хранить при -20 ° C. </li><li> SC-Trp (Синтетический полный средах без триптофана) твердых средах. </li><li> 0,5 см в диаметре стеклянные бусы, стерилизовать в автоклаве. </li><li> РНКазы матча РНКазы обеззараживание раствором. </li><li> ДНКазы / РНКазы бесплатно, стерильные пробирки центрифуги. </li><li> ДНКазы / РНКазы свободной, стерильные конические пробирки. </li><li> ДНКазы / РНКазы свободной, стерильные наконечники аэрозоля с ZAP: 1-200 мл, 100-1000 мл. </li></ol> Б. колонии PCR материалов. <ol><li> ДНК-праймеров, обессоленной и неочищенные. Растворяют в стерильной воде до 50 пмоль / мкл. Хранить при -20 ° C. </li><li> Taq-ДНК-полимераза, буфер, дНТФ. </li><li> ПЦР пробирки. </li></ol> С. ПЦР очистки. <ol><li> ПЦР очистки комплект. </li></ol> Д. гель-электрофореза. <ol><li> Агарозы. </li><li> 1 х КЭ работает буфера (45 мМ Трис-борат и 1 мМ этилендиамина тетраацетат) разводят с 10-кратным TBE. </li><li> Prestained маркер молекулярного веса. </li><li> ДНК загрузки красителя. </li></ol> E. Ограничение пищеварения. <ol><li> Ограничение ферменты, 10x буферов, BSA. </li></ol> Ф. Щелочные лечения РНК-содержащих олиго. <ol><li> 1 М раствора NaOH. </li><li> 1,2 М раствора соляной кислоты. </li><li> 1 М Трис-HCl, рН 7,4 раствором. </li></ol>

generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides

Синтетические короткие нуклеиновых кислот полимеры, олигонуклеотиды (олигонуклеотиды), являются наиболее функциональных и распространенных инструментов молекулярной биологии. Олигонуклеотидов могут быть произведены содержать любую ДНК или РНК, последовательность и могут быть готовы включить широкий спектр базовых и сахар модификаций. Более того, олигонуклеотиды могут быть разработаны для имитации конкретных нуклеиновые кислоты изменений и, таким образом, может служить важным инструментом для исследования последствий повреждения ДНК и механизмов ремонта. Мы обнаружили, что Thermo Scientific Dharmacon РНК-содержащих олигонуклеотидов с длиной от 50 до 80 нуклеотидов может быть особенно подходящим для изучения, в естественных условиях, функции и последствия хромосомных РНК / ДНК гибридов и рибонуклеотидов встроенные в ДНК. РНК / ДНК гибридов легко образуются во время репликации ДНК, ремонт и транскрипции, однако, очень мало известно о стабильности РНК / ДНК гибридов в клетках и в какой степени эти гибриды могут повлиять на генетической целостности клеток. РНК-содержащих олигонуклеотидов, следовательно, представляют собой идеальный вектор ввести рибонуклеотидов в хромосомной ДНК и создания РНК / ДНК гибридов выбранной длины и базового состава. Здесь мы приводим протокол для включения рибонуклеотидов в геном эукариотической дрожжей модели системы / Saccharomyces CEREVISIAE /. Тем не менее, наша лаборатория использовала Thermo Scientific Dharmacon РНК-содержащих олигонуклеотидов для создания РНК / ДНК гибридов на хромосомном уровне в различных клеточных систем, от бактерий до клеток человека.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides at JoVE.com

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Эта работа показывает, как форма РНК / ДНК гибридной на хромосомном уровне и выявить передачи генетической информации от РНК к геномной ДНК в клетках дрожжей.

Генерация РНК / ДНК гибридов в геномной ДНК с помощью преобразования с помощью РНК-содержащих олигонуклеотидов

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Выделение геномной ДНК из хвостов мышей

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Преобразование плазмидной ДНК в E.coli, с использованием метода теплового шока

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Добыча высокомолекулярных ДНК Геномная Вес от почвы и осадков

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Геномная МРТ - общественный ресурс для изучения последовательности Шаблоны в геномной ДНК

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Выделение и характеристика РНК-содержащих экзосом

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Геномная Трансформация Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Тельца</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Селективный захват 5-hydroxymethylcytosine из геномной ДНК

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

Генерация геномных делеций в линии клеток млекопитающих, через CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...