Name: adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00
Duration: 11 min
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作者要感谢在西奈山医院在多伦多，安大略省Rizaldy斯科特博士为他的主RAC1 flox / flox小鼠胚胎成纤维细胞的礼物。这项工作是支持由加拿大卫生研究所（CIHR，2009-93526澳门元）及自然科学和加拿大工程研究理事会（NSERC，RG 327372-06）研究所的资助，以新泽西州经营。 SH和MW CGSMA和CGS - M的奖项，分别从CIHR和NSERC支持。 史蒂夫霍利和梅拉妮遗嘱本文同等贡献。

解冻细胞<ol><li>获得液氮冷冻小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）（以前从个人的原代培养胚胎生成）。 </li><li>沉浸在37小瓶解冻细胞° C的水纷飞的内容，直到完全解冻。 </li><li>新增已与10％胎牛血清和1％的青霉素，链霉素到10cm的细胞培养板为辅的DMEM 9毫升。 </li><li>新增解冻的细胞悬液下降明智的板，岩石板轻轻地分散细胞和地方板块在37 ° C，5％CO 2培养箱中过夜。请注意，如果细胞是敏感的二甲基亚砜（冻结过程），最初的媒体可以与新媒体取代细胞后，坚持板块（约四小时后电镀）。另外请注意解冻后，细胞的汇合冷冻细胞的数量取决于回收率冻结后的细胞，细胞的生长率。 </li></ol>传代细胞<ol start="5"><li>当细胞生长基本上是100％的融合（即：第二天），吸媒体和毫升无菌PBS洗细胞。 </li><li>删除PBS和添加胰蛋白酶1ml含10MM EDTA和地方板的培养箱中培养约5分钟，使细胞脱离板。 </li><li>当细胞分离，添加媒体9毫升的胰酶消化细胞，吸2-3次驱散团块，添加到一个新的板包含媒体9毫升这种悬挂1ML的下拉式上，放入37 ° C培养箱中过夜。或者在媒体的存在，将可灭活该FB的胰蛋白酶，细胞可以先洗净，以稀释的胰蛋白酶。 </li></ol>到盖玻片上的细胞计数及电镀<ol start="8"><li>从孵化器中删除单元格，清洗和trypsinize以前一样，只是这一次加5 - 6ML媒体胰酶消化细胞，而不是9毫升。 </li><li>移液器细胞彻底，以确保完成分解成单细胞悬液，并删除15μL与台盼蓝15μL结合在一个单独的离心管。 </li><li>这种细胞/台盼蓝悬挂移液器向上和向下几次混合，并添加15μL的血球。 </li><li>在显微镜下，死细胞会出现蓝色。在一个4x4的网格的血球计数无色透明/（生活）细胞的数量。重复计数和其他三个4X4的网格（表示甲，乙，丙和D），使用下列公式计算出每微升细胞悬浮： <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="公式1" /></li><li>通过协议优化，我们有决心，电镀在适当的细胞密度为30000细胞在实验结束时的可视化结果。 </li><li>要计算为30,000细胞所需的细胞悬液量，使用下列公式： <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="公式（2）" /></li><li>现在放置到每一个六以及菜以及无菌玻璃盖玻片，每孔中添加媒体2ML，然后添加从你的细胞悬液为30,000细胞所需的量为每口井的下拉明智的。请注意，本实验所用的玻璃盖玻片我们将可视化的细胞，利用荧光显微镜在稍后的时间点，并不是所有的应用程序一定会需要显微镜，从而涵盖可能不须单。 </li></ol>病毒转导<ol start="15"><li>经过几个小时或过夜（有足够的时间，以确保细胞坚持以盖玻片），删除媒体，与无血清DMEM 1ML洗细胞。 </li><li>病毒此外，每口井的无血清培养基中添加1ml到。在这个实验中，Cre重组腺病毒获得商业矢量Biolabs公司。 </li><li>以前的协议优化，感染复数（MOI），500到小学MEFs提供高效的基因转染与细胞活力的作用很少或没有。教学语言可以计算如下： <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="公式3" /> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="公式4" /></li><li>直接计算出的病毒量添加到每口井是被感染的，轻轻摇动板，分散到37℃培养箱隔夜的病毒和地点细胞。 </li><li>第二天早晨，清除病毒含有细胞的媒体毫升无菌PBS冲洗细胞，然后添加2ML定期的媒体，以每口井。 </li><li>体现在这个实验中Rac1的细胞的情况下，发生在约72小时后转的细胞形态变化。 </li></ol>代表性的成果细胞可视化D的染色染料鬼笔环肽与肌动蛋白（成像仅供）和在圭尔夫大学的高级研究中心使用的Leica TCS SP5的多光子共聚焦激光扫描显微镜成像。图1显示了Rac1的flox / flox细胞暴露于腺Cre重组病毒相比，相同的细胞没有接触到病毒的收缩和拉长的形态。 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="图1" /> 图1。Rac1的flox / flox与腺病毒的Cre（左）感染来自同一源（右）相比，未受感染的细胞的细胞之间的比较。

<ol>
	<li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly.">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li><li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. o. w. n. e. y., Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions.">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li><li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion.">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li><li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells.">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li><li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor.">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li><li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus.">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li></ol>

加拿大动物保健委员会规定的准则和法规的规定进行了动物实验。

影随行，充分体现了如何可用于消费特定的基因在体外利用Cre重组酶的重组病毒。本议定书的发展，但是没有揭示值得解决一些特定的点。 <ul><li>腺病毒工作时，适当的安全程序应始终雇用。一个白大褂和手套应戴在任何时间，而病毒的工作。媒体和塑料制品，应与10％，为至少30分钟的漂白处理，和塑料制品应蒸压此后。 </li><li>避免反复冻融病毒的股票，因为这可能会影响病毒滴度，从而减少转导效率。最初应分装成小卷病毒的股票单独管。 </li><li>水分从50-500不等，方法开发和测试过程中，在大多数情况下，没有负面影响细胞活力，高效的转导率观察。 </li><li>腺病毒GFP也被用来在方法发展迅速屏幕传导效率。在实验过程中，以确保病毒感染应进行这种控制（或空载体），不会导致细胞的变化。同样，如果切除的兴趣在你的细胞floxed的基因，不会导致任何细胞的变化（即在形态上或可行性的变化），话，感染腺GFP相同的细胞类型是一个重要的控制使用证明病毒转导发生。 </li></ul>腺的Cre方法的信号级联文化考试之外，还聘请有条件删除从3,4实验动物的基因，和标签 6一个有机体的细胞内特定人群体内。腺病毒载体系统，也可以适应引进比Cre重组酶的基因进入宿主细胞。使用这种传送载体的主要优点是其高转导和基因传递的效率，并缺乏与宿主DNA整合。然而，一代新型重组腺病毒可以是劳动密集型。这里所描述的协议，因此线束利用以前开发的腺Cre重组病毒腺病毒系统的电源，和耦合，与我们的利益，RAC1 floxed等位基因。通过这出实验条件敲，我们已经证实，使用MEFs背着floxed Rac1的等位基因腺Cre重组病毒转导确实造成Rac1的切除，导致细胞形态特征Rac1的缺陷细胞 2,5的变化。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ad-CMV-Cre virus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Biolabs</td>
<td>1045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DME High glucose media 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SH3002201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS Canadian origin 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>CAA15-701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN-STREP 1X solution 100mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Texas Red-X phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T7471</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4549</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts

基因去除各种细胞信号级联的具体组成部分的能力已经在现代信号转导分析的一个不可或缺的工具。通过的Cre - loxP系统的使用是一个特别的方法来实现这个条件删除。这种方法涉及到与loxP位点，Cre重组蛋白的特异性识别序列的侧翼感兴趣的基因。这种酶在Cre介导的loxP位点的重组事件，以及随后切除干预基因 3结果显示，所谓的floxed（两侧loxP位网站）的DNA曝光。存在几种不同的方法来管理Cre重组酶的兴趣网站。在这个视频中，我们展示了使用含有Cre重组酶基因的腺病毒，感染主要小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）从含有一个floxed Rac1的等位基因1胚胎获得。我们选择我们的实验中，Rac1的MEFs理据是明确的形态学变化，可以看到后删除Rac1 的 ，由于2,5中的肌动蛋白细胞骨架的改变。 72小时后病毒转导和表达的Cre，细胞染色使用的肌动蛋白染料鬼笔环肽和使用激光扫描共聚焦显微镜成像。据观察，MEFs曾暴露于腺的Cre病毒出现收缩和拉长未受感染的细胞相比，在形态，与以前的2,5报告一致。 Cre重组酶的腺病毒传递的方法是有利的，因为的腺Cre重组病毒很容易使用，可实现优化的腺病毒感染和通过的Cre基因的缺失，在近100％的细胞。

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Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

在这个视频中，我们使用一种腺病毒携带的Cre重组酶基因感染主要滑鼠胚胎成纤维细胞携带一个floxed Rac1的等位基因。

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Research

JoVE Journal

Biology

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科研

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