Name: adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר Rizaldy סקוט בהר סיני החולים בטורונטו, אונטריו עבור מתנתו של הראשוני Rac1 flox / flox fibroblasts העכבר עובריים. עבודה זו נתמכה על ידי הפעלה מענקים NJ מן המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR, MOP 2009-93526) ואת מדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC, RG 327372-06). SH ו MW נתמכים על ידי CGSMA ו cgs-M פרסים CIHR ו NSERC, בהתאמה. סטיב צוואות האולי ומלאני תרמו באופן שווה על הנייר הזה.

הפשרת התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג fibroblasts עכבר קפוא עובריים (MEFs) (שנוצר בעבר מתרבויות העובר הפרט העיקרי) של חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הפשירי ידי טבילה בקבוקון מים ב 37 ° C עד מתערבל עם תוכן הם מופשר לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9mL של DMEM כי כבר השלימו עם סרום 10% שור עוברית 1% פניצילין, סטרפטומיצין על צלחת תא 10 ס&quot;מ תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ההשעיה תא מופשר ירידה מבחינת הצלחת, סלע את הצלחת בעדינות לפיזור תאים צלחת מקום 37 ° C CO, 5% 2 החממה לילה. שים לב שאם תאים רגישים DMSO (מתהליך קריותרפיה), אמצעי התקשורת הראשוני יכול להיות מוחלף עם התקשורת לאחר טרי התאים דבק הצלחת (כארבע שעות ציפוי לתגובה). כמו כן שים לב כי מפגש של התאים לאחר ההפשרה תלויה במספר תאים קפואים, קצב התאוששות של תאים לאחר הקפאה, ושיעור הצמיחה של התאים. </li></ol> Passaging תאים <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים גדלו למעשה 100% confluency (כלומר: למחרת), לשאוב את התקשורת לשטוף תאים עם 5 מ&quot;ל של PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 1mL של טריפסין המכיל 10mm EDTA צלחת מקום בחממה במשך כ 5 דקות, כדי לאפשר לתאים לנתק מהצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים יש מנותקת, להוסיף 9mL התקשורת לתאי trypsinized, פיפטה 2-3 פעמים כדי לפזר גושים, מוסיפים 1mL של השעיה זו ירידה מבחינת לצלחת חדש המכיל 9mL של התקשורת, במקום הזה לתוך 37 ° C חממה לילה . הנוכחות של FBS בתקשורת יהיה להשבית טריפסין לחילופין, תאים ניתן לכבס הראשון לדלל את טריפסין. </li></ol> ספירת תאים ו ציפוי על גבי תלושי לכסות <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים חממה, לרחוץ trypsinize כמו קודם, אלא שהפעם להוסיף 5-6mL התקשורת חזרה את התאים trypsinized במקום 9mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים פיפטה ביסודיות כדי להבטיח ניתוק מוחלט לתוך ההשעיה תא בודד, ולהסיר 15μL לשלב עם 15μL של trypan כחול בצינור microfuge נפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה תא / trypan כחול על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, כדי להוסיף 15μL hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למיקרוסקופ, תאים מתים יופיעו בצבע כחול. ספירת התאים ברור / צבע (חי) באחד רשתות 4X4 על hemocytometer. חזור על פעולה זו מספר על שלוש רשתות אחרות 4X4 (מצוין, B, C ו-D) ולהשתמש המשוואה הבאה כדי לחשב את מספר התאים לכל μL של השעיה: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="משוואה 1" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אופטימיזציה של פרוטוקול, יש לנו קבעו כי ציפוי 30,000 תוצאות תאים צפיפות התאים המתאימים להדמיה בסיומו של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את נפח תא ההשעיה הדרושים 30,000 תאים, השתמש המשוואה הבאה: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="משוואה 2" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו במקום זכוכית סטרילית לכסות להחליק לתוך היטב כל מנה שישה היטב ולהוסיף 2ml של התקשורת זה היטב, ולאחר מכן להוסיף טיפה חכם מן ההשעיה הסלולרי שלך נפח הנדרש 30,000 תאים לתוך כל טוב. שים לב לכסות תלושי כוס משמשים בניסוי זה כפי שאנו יהיה לדמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלב מאוחר יותר, לא כל היישומים דורשים בהכרח מיקרוסקופ, ובכך מכסה מחליק לא ייתכן שתידרש. </li></ol> וירוס התמרה <ol start="15" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כמה שעות (או זמן מספיק על מנת להבטיח כי התאים לדבוק תלושי כיסוי) למשך הלילה, להסיר ולשטוף התקשורת תאים עם 1mL של סרום ללא DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1mL של סרום ללא מדיה גם עבור כל תוספת של הנגיף. לצורך ניסוי זה, adeno-Cre וירוס הושג מסחרית מן Biolabs וקטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופטימיזציה של פרוטוקול קודם הראה כי ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 500 מספק התמרה גן היעילה ביותר תוך MEFs ראשוני עם מעט או ללא השפעה על כדאיות התא. משרד הפנים יכול להיות מחושב באופן הבא: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="משוואה 3" /> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="משוואה 4" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נפח מחושב של הנגיף ישירות היטב כל זה להיות נגוע, רוק בעדינות את הצלחת לפזר את התאים וירוס מקום לתוך 37 ° C חממה לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להסיר את הווירוס המכילים מדיה מן התאים ולשטוף תאים 1mL סטרילי PBS ולאחר מכן להוסיף 2ml התקשורת קבוע היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של Rac1 תאים שהודגם בניסוי הזה, התרחשו שינויים מורפולוגיים בתאים על כ 72 שעות שלאחר התמרה. </li></ol> נציג תוצאות תאים היו לדמייןד על ידי צביעה עם צבע אקטין phalloidin (למטרות הדמיה בלבד) צילמו באמצעות TCS-Leica SP5 multiphoton מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר במרכז ניתוח מתקדם באוניברסיטת Guelph. איור 1 מציג את המורפולוגיה התכווצה מוארכת של Rac1 flox / flox תאים שנחשפו לנגיף adeno-Cre לעומת התאים אותו לא נחשף לנגיף. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. השוואה בין תאים Rac1 flox / flox נגוע adeno-Cre וירוס (משמאל) לעומת תאים נגוע מאותו מקור (מימין).

<ol>
	<li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly.">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li><li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. o. w. n. e. y., Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions.">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li><li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion.">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li><li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells.">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li><li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor.">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li><li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus.">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית על בריאות בעלי חיים.

הסרטון מלווה מדגים כיצד וירוס רקומביננטי יכול לשמש גן הבלו ספציפי במבחנה באמצעות Cre recombinase. הפיתוח של פרוטוקול זה אך לא לחשוף כמה נקודות מסוים ראוי להתייחסות. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהלי בטיחות פרופר תמיד צריך להיות מועסק בעבודה עם adenoviruses. חלוק מעבדה וכפפות יש ללבוש כל הזמן תוך כדי עבודה עם הנגיף. מדיה כלי פלסטיק צריכים להיות מטופלים עם אקונומיקה 10% לפחות במשך 30 דקות, כלי פלסטיק צריכים להיות autoclaved לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע חזר להקפיא הפשרת המניה וירוס כמו זה יכול להשפיע על titer וירוס ובכך להפחית את היעילות התמרה. כמויות קטנות של המניה אמור בתחילה להיות וירוס aliquoted לתוך צינורות נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MOIs החל 5-50 נבדקו במהלך התפתחות שיטת ושיעורי התמרה יעיל נצפו ברוב המקרים, ללא השפעות שליליות על כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Adeno-GFP נעשה שימוש גם במהלך פיתוח שיטה מהירה מסך יעילות התמרה. שליטה זו (או וקטור ריק) צריכה להתנהל במהלך הניסוי על מנת להבטיח כי זיהום ויראלי לבד אינו תוצאה של השינויים התאיים. באופן דומה, אם מוציא את הגן floxed עניין בתאים שלך אינו תוצאה של שינויים הסלולר (כלומר שינויים במורפולוגיה או הכדאיות), ואז מדביק את סוג התא אותו עם adeno-GFP הוא פקד חשוב להשתמש על מנת להוכיח כי התמרה וירוס התרחשות. </li></ul> מעבר לבחינת איתות מפלי בתרבות, הגישה adeno-Cre גם הועסק in vivo כדי להסיר תנאי גנים מחיות הניסוי 3,4, ו לתייג אוכלוסיות ספציפיות של תאים בתוך האורגניזם 6. המערכת adenovirus יכול גם להיות מותאם להציג גנים אחרים מאשר Cre recombinase לתאי המארח. שני היתרונות העיקריים של שימוש זה וקטור משלוח הם התמרה גבוהה ואספקה ​​יעילות גן, וחוסר אינטגרציה עם ה-DNA המארח. אולם, את הדור של adenoviruses רקומביננטי רומן יכול להיות עבודה אינטנסיבית. הפרוטוקול המתואר כאן ולכן רותמת את העוצמה של המערכת adenoviral ידי ניצול שפותחו בעבר adeno-Cre וירוסים, צימוד זה עם אלל floxed שלנו של עניין, Rac1. דרך לדפוק את הניסוי הזה מותנה, יש לנו אישר כי התמרה באמצעות וירוס adeno-Cre של MEFs נושאת אלל Rac1 floxed אכן לגרום כריתה של Rac1 המוביל את השינויים האופייניים מורפולוגיה תאית של תאים Rac1 מחסר 2,5.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ad-CMV-Cre virus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Biolabs</td>
<td>1045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DME High glucose media 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SH3002201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS Canadian origin 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>CAA15-701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN-STREP 1X solution 100mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Texas Red-X phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T7471</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4549</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts

היכולת גנטית להסיר רכיבים ספציפיים של מפלי איתות שונים בתא כבר כלי אינטגרלי ניתוח אות המודרנית התמרה. שיטה אחת מסוימת כדי להשיג זאת היא באמצעות מחיקה מותנה שימוש במערכת Cre-loxP. שיטה זו כרוכה איגוף את הגן של עניין עם אתרי loxP, שהם רצפי הכרה ספציפית לחלבון recombinase Cre. חשיפה של ה-DNA המכונים (מוקף אתר loxP) floxed זה תוצאות האנזים במקרה Cre בתיווך רקומבינציה באתרי loxP, ואת הבאים כריתה של הגן להתערב 3. קיימים מספר שיטות שונות כדי לנהל Cre recombinase לאתר של עניין. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השימוש adenovirus המכיל את הגן Cre recombinase להדביק fibroblasts העכבר העיקרי עובריים (MEFs) המתקבלים עוברים המכילים אלל floxed Rac1 1. הרציונל שלנו לבחירת Rac1 MEFs לניסויים שלנו היא כי שינויים מורפולוגיים ברור ניתן לראות על מחיקה של Rac1, עקב שינויים cytoskeleton אקטין 2,5. 72 שעות לאחר התמרה ויראלי ביטוי Cre, התאים היו מוכתמים באמצעות צבע אקטין phalloidin הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. היה נראה כי MEFs שנחשפו לנגיף adeno-Cre הופיע התכווץ ומוארך במורפולוגיה לעומת תאים נגוע, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 2,5. השיטה adenovirus המסירה recombinase Cre יתרון כמו וירוס adeno-Cre זמין בקלות, באמצעות מחיקת הגן Cre של כמעט 100% של התאים ניתן להשיג עם זיהום adenoviral אופטימיזציה.

Watch this Scientific Journal Video about Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts at JoVE.com

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

בסרטון זה אנו משתמשים adenovirus נושאת את הגן Cre recombinase להדביק fibroblasts העכבר העיקרי העוברית נושאת אלל floxed Rac1.

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts עכבר עובריים עם פקטור ארבעה תמלול, דוקסיציקלין ועין מתנהלת מערכת התמרה lentiviral

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Assaying את היכולת של מולקולות איתות Diffusible כדי כיוון מחדש עובריים האקסונים Commissural השדרה

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

הסרת פיברובלסטים מהירה מתרבויות צפיפות גבוהות אדם תאי גזע עובריות

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

אברון תחבורה בתרבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

גלוקוז ספיגה מדידה ותגובה גירוי אינסולין ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מיוטובים ראשוניים אדם מתורבת

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...