Name: adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Rizaldy Скотт в больнице Маунт Синай в Торонто, Онтарио за его дар первичной Rac1 FLOX / FLOX эмбриональных фибробластов мыши. Эта работа была поддержана операционной гранты NJ от Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR, СС 2009-93526) и естествознания и техники Научно-исследовательского совета Канады (NSERC, Р. Г. 327372-06). SH и МВ поддерживаются CGSMA и РКУ-М награды от CIHR и NSERC, соответственно. Стив Холи и Мелани Уиллс способствовали в равной степени к этой статье.

Размораживание клетки <ol><li> Получить замороженных мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) (созданный ранее из отдельных эмбриона первичных культур) с жидким азотом. </li><li> Оттепель клетки путем погружения флакона в 37 ° С воду с закрученной пока содержимое полностью оттаять. </li><li> Добавить 9mL из DMEM, который был с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина стрептомицин к культуре пластины ячейки 10см. </li><li> Добавить талой клеточной суспензии по каплям к пластине, рок-пластинка аккуратно, чтобы разогнать клетки и поместить пластинку в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора в одночасье. Заметим, что если клетки чувствительны к ДМСО (от замораживания процесса), начальные средства массовой информации может быть заменен на свежий СМИ после того, клетки присоединившимся к пластине (примерно четыре часа после покрытия). Также отметим, что слияние клеток после оттаивания зависит от количества клеток заморожены, скорость восстановления клеток после замораживания, а темп роста клеток. </li></ol> Пассирования клетки <ol start="5"><li> Когда клетки росли, чтобы по существу, 100% слияния (то есть: на следующий день), аспирация от средств массовой информации и промыть клетки с 5 мл стерильной PBS. </li><li> Удалить PBS и добавьте 1 мл трипсина содержащей 10 мМ ЭДТА и место пластину в инкубаторе в течение примерно 5 минут, чтобы дать клеткам отсоединиться от пластины. </li><li> Когда клетки имеют индивидуальный добавить 9mL средств массовой информации для трипсином клетки, пипетки 2-3 раза, чтобы разогнать скопления, добавьте 1 мл этой суспензии по каплям на новую пластину, содержащую 9mL средств массовой информации, и место это в 37 ° С инкубатор ночь . Наличие FBS в СМИ инактивирует трипсин альтернативно, клетки могут быть вымыты первый разбавить из трипсина. </li></ol> Подсчет и покрытие клеток на покрытие проскальзывает <ol start="8"><li> Удалить клетки из инкубатора, вымыть и trypsinize как и раньше, но на этот раз добавить 5-6 мл СМИ назад к трипсином клетки вместо 9mL. </li><li> Внесите клетки тщательно для обеспечения полной диссоциации в суспензии отдельных клеток, и удалить 15μL сочетать с 15μL трипановой синий в отдельной трубке отцентрифугировать. </li><li> Смешайте эту ячейку / трипанового синего подвески с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, и добавить к 15μL гемоцитометра. </li><li> Под микроскопом, мертвые клетки появится синий. Подсчитайте количество очистки / бесцветный (живых) клеток в одном из 4X4 сеток на гемоцитометра. Повторите эту рассчитывать на три другие сетки 4X4 (обозначается A, B, C и D) и использовать следующее уравнение для расчета количества клеток в мкл подвеска: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="Уравнение 1" /></li><li> Благодаря оптимизации протокола, мы определили, что покрытие 30000 клеток приводит к соответствующей плотности клеток для визуализации в конце эксперимента. </li><li> Чтобы рассчитать объем клеточной суспензии необходимое для 30000 ячеек используйте следующее уравнение: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="Уравнение 2" /></li><li> Теперь место стерильную скольжения покровного стекла в каждую лунку шесть хорошо блюдо и добавить 2 мл среды в каждую лунку, а затем добавить по каплям из вашей клеточной суспензии объем, необходимый для 30000 клеток в каждую лунку. Обратите внимание, что скользит остекления используются для этого эксперимента, как мы будем визуализировать клетки с помощью флуоресцентной микроскопии на более позднем этапе, не все приложения будут обязательно требует микроскопии, и, таким образом покрытие не скользит могут потребоваться. </li></ol> Вирус трансдукция <ol start="15"><li> После нескольких часов или на ночь (достаточно времени для того, чтобы клетки придерживаются крышки слипы), удалить средства массовой информации и мыть клетки с 1 мл бессывороточной DMEM. </li><li> Добавить 1 мл сыворотки, свободных средств массовой информации в каждую лунку для добавления вируса. Для этого эксперимента, адено-вирус Cre было получено коммерчески Векторные Биолабс. </li><li> Предыдущая оптимизация протоколов показал, что множественность заражения (МВД) в 500 обеспечивает высокую эффективность генной трансдукции в первичные MEFs практически не влияет на жизнеспособность клеток. МВД может быть рассчитана следующим образом: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="Уравнение 3" /> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="Уравнение 4" /></li><li> Добавить расчетный объем вирус непосредственно в каждую лунку, которая должна быть инфицированы, мягко рок пластины, чтобы рассеять вирус и поместить клетки в 37 ° С инкубатор в одночасье. </li><li> Следующим утром, удалить вирус-содержащих средств массовой информации из клетки и мыть клеток в 1 мл стерильной PBS, а затем добавить 2 мл регулярных средств массовой информации в каждую лунку. </li><li> В случае Rac1 клетки примером в этом эксперименте, морфологические изменения произошли в клетки примерно в 72 часа после трансдукции. </li></ol> Представитель Результаты Клетки визуализироватьг окрашиванием актина красителя фаллоидином (для работы с изображениями целей) и отображение использовании Leica TCS SP5-многофотонной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии на Расширенный Центра анализа в Университете гвельфов. На рисунке 1 показан контракт и удлиненные морфологии Rac1 FLOX / FLOX клетки, которые подвергались адено-вирус Cre сравнению с тем же клетки не подвергаются воздействию вируса. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Сравнение Rac1 FLOX / FLOX клетки, инфицированные адено-вирус Cre (слева) по сравнению с незараженных клеток из того же источника (справа).

<ol>
	<li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly.">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li><li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. o. w. n. e. y., Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions.">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li><li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion.">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li><li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells.">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li><li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor.">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li><li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus.">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li></ol>

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Канадский совет по уходу за животными.

Сопровождающее видео пример того, как рекомбинантный вирус может быть использован для акцизных конкретных генов в пробирке использованием Cre рекомбиназы. Развитие этого протокола однако же выявить некоторые конкретные моменты стоит адресации. <ul><li> Надлежащие процедуры безопасности должны всегда быть использованы при работе с аденовирусы. Лабораторный халат и перчатки следует носить все время при работе с вирусом. Средства массовой информации и пластиковая посуда, следует относиться с 10% гипохлоритом натрия в течение 30 минут, и пластиковая посуда необходимо обрабатывать в автоклаве после этого. </li><li> Избегать повторного замораживания-оттаивания вирус акции, поскольку это может повлиять титра вируса и тем самым снизить эффективность трансдукции. Небольшие объемы вирус акции должны быть первоначально аликвоты в отдельные пробирки. </li><li> Mois в пределах от 50-500 были испытаны во время метод развития и эффективной ставки трансдукции наблюдались в большинстве случаев, без негативного влияния на жизнеспособность клеток. </li><li> Адено-GFP был также использован во время разработки метода быстро экрана трансдукции эффективности. Этот контроль (или пустой вектор) должны быть проведены в течение эксперимента, чтобы вирусная инфекция сама по себе не приводят к клеточные изменения. Аналогичным образом, если иссечение floxed интересующего гена в клетках организма не приводит к какой-либо клеточных изменений (то есть изменения в морфологии или жизнеспособности), то заражение одного типа клетки с адено-GFP является важным управления для использования, чтобы продемонстрировать, что вирус трансдукции происходит. </li></ul> Помимо изучения сигнальных каскадов в области культуры, адено-Cre подход был также занятых в естественных условиях условно удалить гены от экспериментальных животных 3,4, и для обозначения конкретных популяций клеток в организме 6. Аденовирус система может быть адаптирована ввести гены, кроме Cre рекомбиназы в клетки хозяина. Два главных преимущества использования данной доставки вектора являются его высокая эффективность трансдукции и доставки генов и отсутствие интеграции с ДНК хозяина. Тем не менее, поколение новых рекомбинантных аденовирусов может быть трудоемким. Протокол, описанный здесь, поэтому использует мощь аденовирусной системы за счет использования ранее разработанных адено-Cre вируса, и связи, что с нашим floxed аллель интересов, Rac1. С помощью этого условного выбить эксперимента, мы подтвердили, что трансдукция использованием адено-вирус Cre MEFs проведения floxed аллель Rac1 действительно причинить иссечение Rac1, ведущие к изменениям в клеточной морфологии характерно Rac1-дефицитных клеток 2,5.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ad-CMV-Cre virus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Biolabs</td>
<td>1045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DME High glucose media 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SH3002201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS Canadian origin 500mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>CAA15-701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN-STREP 1X solution 100mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Texas Red-X phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T7471</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4549</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts

Способность к генетически удалить определенные компоненты различных каскадов сигнализации клетка была неотъемлемым инструментом в современном анализе передачи сигнала. Один конкретный метод для достижения этой условной удаление через использование Cre-loxP системы. Этот метод предполагает фланговые гена с сайтами loxP, которые являются специфическими последовательностями признания белка рекомбиназы Cre. Воздействие на так называемые floxed (окружении сайт loxP) ДНК, чтобы этого фермента приводит к Cre-опосредованной рекомбинации мероприятие в loxP сайтов и последующего вырезания промежуточных ген 3. Несколько различных методов существуют, чтобы управлять Cre рекомбиназы к месту интерес. В этом видео мы продемонстрируем использование аденовируса, содержащего ген Cre рекомбиназы заразить первичных мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs), полученных из эмбрионов, содержащих floxed Rac1 аллель 1. Наши обоснование выбора Rac1 MEFs для наших экспериментов является то, что ясно морфологические изменения можно увидеть на удаление Rac1, в связи с изменениями в актина цитоскелета 2,5. 72 часов после вирусной трансдукции и Cre выражения, клетки окрашивали красителем фаллоидином актина и отображение с помощью конфокальной микроскопии лазерного сканирования. Было отмечено, что MEFs, которые были подвержены адено-вирус появилась Cre контракту и вытянутые в морфологии по сравнению с незараженных клеток, в соответствии с предыдущими докладами 2,5. Аденовирус способ доставки Cre рекомбиназы выгодно как адено-Cre вирус легко доступны, и удаление гена с помощью Cre почти в 100% клеток может быть достигнуто за счет оптимизации аденовирусной инфекции.

Watch this Scientific Journal Video about Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts at JoVE.com

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

В этом видео мы используем аденовирус-носителей гена Cre рекомбиназы заразить первичных мышиных эмбриональных фибробластов проведения floxed Rac1 аллеля.

Аденовирус-опосредованной Генетические Удаление сигнальных молекул в культуре первичных мышиных эмбриональных фибробластов

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Живая съемка Плотные-ядерные Пузырьки в начальной культивированный нейронов гиппокампа

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки путем перепрограммирования мышиных эмбриональных фибробластов с Четыре фактора транскрипции, доксициклин индуцибельной лентивирусов системы трансдукция

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Препарирование зубчатой ​​извилине гиппокампа от взрослой мыши

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Опробование Способность к диффузии сигнальных молекул переориентировать Эмбриональные спинного спаечный Аксоны

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

В естественных изображений и лечебных процедур в Ортотопическая мышиной модели рака яичников

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Быстрое удаление фибробластов с высокой плотностью эмбриональных стволовых клеток культур

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Система<em&gt; Бывших естественных условиях</em&gt; Культивирования эмбриональных поджелудочной железы

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Быстрое Генетический анализ эпителиальных мезенхимальных сигнализации во время регенерации волос

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Органелл Транспорт в культуре<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Клетки: S2 клеточной линии и первичных нейронов.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Измерение поглощения глюкозы и ответ на стимуляцию инсулина в<em&gt; In Vitro</em&gt; Культурные человеческие первичные миопуты

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...