Name: blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates at JoVE.com

Wij danken Michael Reth, Hermann Schägger, en Margarita Camacho-Carvajal voor de wetenschappelijke ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door FORSYS van het Bundesministerium für Bildung en Forschung (BMBF), door BIOSen van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), en mede ondersteund door de Excellence initiatief van de Duitse federale en deelstaatregeringen (SGR-4, Spemann Graduate School ).

<ol>
	<li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer:+identification+of+three+dimer-specific+subunits.">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells.">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li><li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+words+to+literature+in+structural+proteomics.">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li><li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li><li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response.">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li><li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor.">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li><li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+(NAMOS-assay)+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes.">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li><li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis.">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li></ol>

In deze studie beschrijven we de analyse van de mediterrane partnerlanden door BN-PAGE. Een 2D-aanpak wordt gebruikt om eerst aparte mediterrane partnerlanden onder natieve omstandigheden, en vervolgens om verder te verdelen in hun afzonderlijke componenten door een tweede dimensie SDS-PAGE. Monsters worden bereid uit cellysaten. Voor de oplosbaarheid van een groot aantal mediterrane partnerlanden, is een geschikt reinigingsmiddel nodig, die behoudt de structuur van het eiwit complexen. Hier maken we gebruik van 0,1% Triton X-100. Echter, de optimale wasmiddel en de geschikte concentratie moeten empirisch worden bepaald voor elke MPC. In het geval van Triton X-100, bijvoorbeeld, heeft gemeld dat lage concentraties detergent de identificatie van een dimeer vorm van de F 1 staat F 0-ATPase complex (Arnold, Pfeiffer et al.. 1998). Hogere Triton X-100-concentraties, echter leiden tot de dissociatie van het dimeer en een corresponderende toename van de monomere F 1 F 0-ATPase complex. Dit is in lijn met een van onze vroegere studies werden we zien dat de multivalente T-cel-receptor complex (TCR) is behouden wanneer geëxtraheerd met lage concentraties van Brij 96, terwijl het gebruik van hogere concentratie of van een ander schoonmaakmiddel digitonine resultaten genoemd in de winning van monomere TCR (Schamel, Arechaga et al.. 2005). Veelgebruikte detergenten die getest kunnen worden zijn onder digitonine (0,5 tot 1%), Triton X-100 (0,1 tot 0,5%), Brij 96 (0,1 tot 0,5%), of dodecylmaltoside (0,1 tot 0,5%). Deze reagentia zijn niet-ionische detergenten, die meestal het beste voor MPC stabiliteit. Wees ervan bewust dat contact met de SDS en andere sterke reinigingsmiddelen moet worden vermeden (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al.. 2004). Dialyse van de lysaten nodig is om MPC scheiding in een BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Bereiken; (Heiss, Junkes et al. 2005.). Het lijkt erop dat de aanpassing van de zoutconcentratie of de verwijdering van een laag moleculair gewicht onzuiverheden is van cruciaal belang voor een hoge resolutie. Het is opmerkelijk dat ook de membraan de voorbereidingen en de mediterrane partnerlanden, die zijn immunopurified en later geëlueerd van het antilichaam, zijn geschikt voor BN-PAGE (Swamy, Siegers et al.. 2006). In beide gevallen hebben de monsters niet te worden gedialyseerd voor BN-pagina scheiding, als membraan lysis of elutie wordt uitgevoerd in BN-lysis buffer. Voor eiwit scheiding door BN-PAGE, is de kleurstof Coomassie blauwe nodig, die unspecifically bindt aan eiwitten en dekt ze met negatieve ladingen. Daarbij Coomassie blauw maakt de elektroforetische mobiliteit van eiwitten naar de kathode bij een neutrale pH (Schägger en von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al. 1994.). Bovendien, Coomassie blauw voorkomt eiwitaggregatie in het stapelen gel tijdens de elektroforese. Voor de BN-PAGE, Coomassie G250 moet worden gebruikt in plaats van Coomassie blauw R250 of colloïdale Coomassie blues. Voordat u een BN-gel, is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het percentage van de gel past op de verwachte grootte van de MPC van belang. Prefab BN-gels met verschillende hellingen en geschikte buffers zijn verkrijgbaar bij Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Maar BN-gels kunnen ook worden bereid met behulp van een gradiënt mixer, samen met een persistaltic pomp. Het garanderen van een intact gradiënt, moet de vloeistof continu stroom tijdens het storten en bellen moet worden vermeden. Wij raden het laden van de verschillende verdunningen monster op de gel, omdat overbelasting kan leiden tot eiwit neerslag tijdens het elektroforese proces. Daarnaast moet BN-gels worden uitgevoerd bij 4 ° C om eiwitafbraak te voorkomen en te houden van de mediterrane partnerlanden intact. Na de BN-PAGE, visualisatie van de mediterrane partnerlanden kan worden bereikt door Coomassie brilliant blue kleuring, zilverkleuring of immunoblotting. Eiwitbanden gevisualiseerd door Coomassie of zilverkleuring zijn geschikt voor verdere analyse met behulp van massaspectrometrie (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al.. 2004). In het geval van immunoblotting, de optimale overdracht van voorwaarden voor de mediterrane partnerlanden van belang te hebben empirisch worden bepaald. Wees ervan bewust dat Coomassie blauw ook wordt overgedragen tijdens blotting van een BN-gel. Daarom zal de gel kleurloos zijn na de succesvolle overdracht, terwijl het membraan zal een blauwe kleur uit te oefenen. Verder is het belangrijk om te vermelden dat niet elke primaire antilichaam, die werkt voor de detectie na SDS-PAGE, is van toepassing op immunoblotting bij de BN-PAGE. Het kan gebeuren dat niet antilichamen doen MPC van belang te herkennen omdat hun epitoop is verborgen in de natieve conformatie van de eiwitten. Om dit probleem te verhelpen, is het mogelijk om de eiwitten te denatureren binnen de BN-gel voorafgaand aan de overdracht door koken van de gel binnenkort in 1x SDS sample buffer. In ons voorbeeld hebben we niet direct onder de BN-gel om detectie van eiwit bands. In plaats daarvan hebben we verder onderverdeeld de BN-PAGE gescheiden lysaat door een tweede dimensiop SDS-PAGE. In de tweede dimensie SDS-gel, monomere proteïnen migreren binnen een hyperbolische diagonaal als gevolg van de gradiënt gel in de eerste en de lineaire gel in de tweede dimensie (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al.. 2004). Hierdoor kan de eenvoudige identificatie van de mediterrane partnerlanden, omdat ze zijn gelokaliseerd onder deze hyperbolische diagonaal. Subcomponenten van een welomschreven MPC worden gescheiden in een verticale lijn in de tweede dimensie SDS-PAGE. Componenten die bestanddelen van meerdere dinstinct mediterrane partnerlanden kunnen worden geïdentificeerd op een horizontale lijn op basis van de grootte van het MPC. Echter, het dient te worden beschouwd dat verschillende eiwitten plekken verschijnen in een verticale lijn ook kan deel uitmaken van afzonderlijke complexen die migreren op dezelfde positie in de BN-PAGE. Het definitieve bewijs dat ze aanwezig zijn in dezelfde MPC kan worden verkregen door een antilichaam-gebaseerde gel shift assay. In deze test, is cellulaire lysaat geïncubeerd met een antilichaam tegen een eiwit vertegenwoordigd door een van de geïdentificeerde plekken voorafgaand aan de BN-PAGE. Dit resulteert in een verschuiving van alle mediterrane partnerlanden die dit eiwit bevatten naar een hogere moleculaire massa in de eerste dimensie. Andere eiwitten die ook een deel van deze mediterrane partnerlanden zal ondergaan deze complexe specifieke shift en zijn dus gemakkelijk te herkennen in de tweede dimensie SDS-gel. Niet alleen de samenstelling van de mediterrane partnerlanden kunnen worden geanalyseerd door BN-PAGE, maar ook de bepaling van hun stoichiometrie is mogelijk (Schamel en Reth 2000), (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al. 2007.). Voor dit doel kan een NAMOS assay (native antilichaam-gebaseerde mobiliteit-shift assay) worden uitgevoerd. Net als in de antilichaam-gebaseerde gel shift assay, zijn de cellulaire lysaten geïncubeerd met monoklonaal subunit-specifieke antilichamen. Dit leidt tot de inductie van elektroforetische immunoshifts in de BN-gels, die de gevolgtrekking toestaan ​​van de omvang van de verschuiving op de stoichiometrie van de mediterrane partnerlanden In conlusion, BN-PAGE is geschikt voor de identificatie van mediterrane partnerlanden en de bepaling van hun omvang, samenstelling, evenals de relatieve overvloed. Uitgevoerd als een NAMOS test, maar biedt ook de mogelijkheid om de stoichiometrie van een bepaalde MPC te bepalen. Gezien de algemene toepasbaarheid, deze techniek is een zeer nuttig hulpmiddel voor de karakterisering van de mediterrane partnerlanden (Dekker, Müller et al. 1996.), (Wittig en Schagger 2008), (Wagner, Rehling et al. 2009.), (Wittig en Schägger 2009) .

blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates

Multiprotein complexen (MPL) spelen een cruciale rol in cell signaling, omdat de meeste eiwitten zijn te vinden in functionele of regelgeving complexen met andere eiwitten (Sali, Glaeser et al.. 2003). Zo is de studie van eiwit-eiwit interacties netwerken vereist de gedetailleerde karakterisering van de mediterrane partnerlanden te krijgen een integratieve begrip van eiwit-functie en regulatie. Voor identificatie en analyse, moet mediterrane partnerlanden worden gescheiden onder natieve omstandigheden. In deze video, beschrijven we de analyse van de mediterrane partnerlanden door de blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). BN-PAGE is een techniek dat de scheiding van de Mediterrane partnerlanden staat in een natieve conformatie met een hogere resolutie dan die door gel-filtratie of sucrose dichtheid ultracentrifugatie, en is daarom nuttig om te bepalen MPC omvang, samenstelling, en relatieve rijkdom (Schägger en von Jagow 1991) ; (Schägger, Cramer et al. 1994.). Door deze methode worden de eiwitten gescheiden op basis van hun hydrodynamische grootte en de vorm in een polyacrylamide matrix. Hier tonen we de analyse van de mediterrane partnerlanden van het totale cellulaire lysaten, erop te wijzen dat lysaat dialyse is de cruciale stap om BN-PAGE te maken van toepassing zijn op deze biologische monsters. Met behulp van een combinatie van de eerste dimensie BN-en de tweede dimensie SDS-PAGE, laten we zien dat mediterrane partnerlanden gescheiden door BN-PAGE kan verder onderverdeeld worden in hun afzonderlijke bestanddelen door middel van SDS-PAGE. Visualisatie van de MPC componenten op gel scheiding wordt uitgevoerd door standaard immunoblotting. Als een voorbeeld voor MPC analyse door BN-PAGE, hebben we gekozen voor de goed gekarakteriseerde eukaryotische 19S, 20S en 26S proteasomen.

Watch this Scientific Journal Video about Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates at JoVE.com

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In deze video, beschrijven we de karakterisering van multiprotein complexen (MPL), door blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). In een eerste dimensie, worden gedialyseerd cellulaire lysaten gescheiden door BN-PAGE om individuele Mediterrane partnerlanden te identificeren. In een tweede dimensie SDS-PAGE, zijn mediterrane partnerlanden van belang verder onderverdeeld naar hun kiezers te analyseren door immunoblotting.

Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Denaturerende gradiënt Gel Elektroforese (DGGE)

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denatureren Ureum polyacrylamide gel elektroforese (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Gieten en runnen van een eiwitgel door hergebruik van Commercial Cassettes

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarosegelelektroforese voor de scheiding van DNA fragmenten

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

AFM-gebaseerde kaart brengen van de elastische eigenschappen van celwanden: op weefsel-, cellulair en Subcellulaire Resoluties

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucine agarosegelelektroforese: Western blotting voor hoge molecuulgewicht glycoproteïnen


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...