Name: blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00
Duration: 12 min 3 s
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Nous tenons à remercier Michael Reth, Hermann Schagger, et Margarita Camacho-Carvajal d&#39;appui scientifique. Ce travail a été financé par de la Bildung FORSYS Bundesministerium für Forschung et (BMBF), par BIOSS de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), et soutenu en partie par l&#39;Initiative d&#39;excellence des gouvernements fédéral allemand et de l&#39;Etat (CGC-4, Spemann Graduate School ).

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	<li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer:+identification+of+three+dimer-specific+subunits.">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. 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Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li><li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response.">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li><li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor.">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li><li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+(NAMOS-assay)+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes.">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li><li>Swamy, M., Siegers, G. 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Dans cette étude, nous décrivons l&#39;analyse des PPM par BN-PAGE. Une approche 2D est utilisée d&#39;abord PPM séparés dans des conditions natives, puis de continuer à les subdiviser en leurs composants individuels par une deuxième dimension SDS-PAGE. Les échantillons sont préparés à partir de lysats cellulaires. Pour la solubilisation des PPM nombreuses, un détergent approprié est nécessaire, ce qui préserve la structure des complexes protéiques. Ici, nous utilisons 0,1% de Triton X-100. Toutefois, le détergent et sa concentration optimale appropriées doivent être déterminées empiriquement pour chaque PPM. En cas de Triton X-100, par exemple, il a été rapporté que les concentrations de détergent bas permettent l&#39;identification d&#39;une forme dimérique de la F 1 F 0-ATPase complexes (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Supérieur Triton X-100 concentrations, cependant, conduire à la dissociation du dimère et une augmentation correspondante de l&#39;monomère F 1 F 0-ATPase complexes. Ceci est en ligne avec l&#39;un de nos études antérieures, ont été, nous montrons que le complexe récepteur des cellules T multivalents (TCR) est conservée lorsque extrait avec de faibles concentrations de Brij 96, tandis que l&#39;utilisation de plus forte concentration de détergent ou d&#39;un autre appelé des résultats de la digitonine l&#39;extraction des monomères TCR (Schamel, Aréchaga et al. 2005). Détergents couramment utilisés qui peuvent être testés comprennent digitonine (0,5 à 1%), le Triton X-100 (0,1 à 0,5%), Brij 96 (0,1 à 0,5%), ou dodecylmaltoside (0,1 à 0,5%). Ces réactifs sont des détergents non ioniques, qui tendent à être les meilleurs pour la stabilité MPC. Soyez conscient que le contact avec SDS et d&#39;autres détergents puissants doivent être évités (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Dialyse des lysats est nécessaire pour obtenir la séparation MPC dans un BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004.); (Heiss, Junkes et al 2005).. Il semble que l&#39;ajustement de la concentration de sel ou de l&#39;élimination des impuretés de faible poids moléculaire est cruciale pour une grande résolution. Il est à noter que également des préparations de membrane et des PPM, qui ont été immunopurifié et plus tard sur élue à partir de l&#39;anticorps, sont adaptés pour BN-PAGE (Swamy, Siegers et al. 2006). Dans les deux cas, les échantillons n&#39;ont pas à être dialysé pour BN-PAGE de séparation, si lyse membrane ou élution est effectuée dans BN-tampon de lyse. Pour la séparation des protéines par BN-PAGE, le colorant bleu de Coomassie est nécessaire, qui se lie aux protéines non spécifique et les couvre de charges négatives. Ainsi, le bleu de Coomassie permet la mobilité électrophorétique des protéines vers la cathode à pH neutre (Schagger et Jagow 1991); (Schagger, Cramer et al, 1994).. Par ailleurs, le bleu de Coomassie empêche l&#39;agrégation des protéines dans le gel empilage durant l&#39;électrophorèse. Pour BN-PAGE, Coomassie G250 doit être utilisé au lieu du bleu de Coomassie R250 ou colloïdale bleus Coomassie. Avant de lancer une BN-gel, il est nécessaire de s&#39;assurer que le pourcentage du gel s&#39;adapte à la taille attendue de la MPC d&#39;intérêt. Préfabriqué BN-gels avec différents gradients et tampons appropriés sont disponibles commercialement auprès de Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Mais BN-gels peuvent également être préparés en utilisant un mélangeur de gradient avec une pompe persistaltic. Afin de garantir un gradient intactes, le liquide doit s&#39;écouler en permanence pendant la coulée et les bulles doivent être évités. Nous recommandons le chargement des dilutions des échantillons différents sur le gel, car la surcharge peut conduire à la précipitation des protéines au cours du procédé d&#39;électrophorèse. En outre, BN-gels doivent être exécutés à 4 ° C pour prévenir la dégradation des protéines et de garder intactes les PPM. Après BN-PAGE, la visualisation des PPM peut être réalisé par coloration bleu brillant de Coomassie, coloration à l&#39;argent ou d&#39;immunoblot. Bandes de protéines visualisés par coloration au bleu de Coomassie ou en argent sont adaptés à une analyse approfondie par spectrométrie de masse (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). En cas d&#39;immunoblot, les conditions de transfert optimal pour les PPM d&#39;intérêt doivent être déterminées empiriquement. Soyez conscient que le bleu de Coomassie est également transféré au cours d&#39;un buvard BN-gel. Par conséquent, le gel sera incolore après le transfert réussi, tandis que la membrane va exercer une couleur bleue. De plus, il est important de mentionner que chaque anticorps primaire, qui travaille pour la détection après SDS-PAGE, est applicable à immunoblot après BN-PAGE. Il peut arriver que les anticorps ne reconnaissent pas le MPC d&#39;intérêt parce que leur épitope est caché dans la conformation native des protéines. Pour surmonter ce problème, il est possible de dénaturer les protéines au sein du BN-gel avant le transfert en faisant bouillir le gel peu dans le tampon 1x échantillon de SDS. Dans notre exemple, nous n&#39;avons pas l&#39;objet de la BN-gel directement à la détection des bandes de protéines. Au lieu de cela, nous avons divisé le BN-PAGE, séparés par une seconde lysat dimensisur SDS-PAGE. Dans la deuxième dimension sur gel SDS, les protéines monomériques migrer à l&#39;intérieur d&#39;une diagonale hyperboliques due au gel de gradient dans le premier et le gel linéaire dans la deuxième dimension (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Cela permet l&#39;identification facile des PPM, car elles sont localisées en dessous de cette diagonale hyperbolique. Sous-composants d&#39;un MPC distincts sont séparés dans une ligne verticale dans la deuxième dimension SDS-PAGE. Les composants qui sont des constituants des PPM dinstinct plusieurs peuvent être identifiés sur une ligne horizontale en fonction de la taille de la MPC. Cependant, il doit être considéré que les taches plusieurs protéines figurant dans une ligne verticale pourrait aussi faire partie de complexes distincts qui migrent à la même position dans BN-PAGE. La preuve définitive qu&#39;ils sont présents dans la même MPC peut être obtenue par un dosage à base d&#39;anticorps gel de quart de travail. Dans cet essai, lysat cellulaire est incubée avec un anticorps dirigé contre une protéine représentée par l&#39;un des endroits identifiés avant BN-PAGE. Il en résulte un décalage de tous les PPM qui contiennent cette protéine vers une masse moléculaire plus élevée dans la première dimension. D&#39;autres protéines qui sont aussi une partie de ces PPM va subir ce changement de complexes spécifiques et sont donc faciles à identifier dans la deuxième dimension SDS-gel. Non seulement la composition des PPM peuvent être analysés par BN-PAGE, mais aussi la détermination de leur stœchiométrie est possible (et Schamel Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al 2007).. À cette fin, un test NAMOS (native à base d&#39;anticorps mobilité changement de dosage) peut être effectuée. Comme dans le dosage des anticorps gel à base de quart de travail, les lysats cellulaires sont incubés avec des anticorps monoclonaux sous-unité d&#39;anticorps spécifiques. Cela conduit à l&#39;induction de immunoshifts électrophorétique dans les gels BN-, qui permettent l&#39;inférence à partir de la mesure de l&#39;évolution de la stoechiométrie des PPM En guise de conclusion, BN-PAGE est approprié pour l&#39;identification des PPM et la détermination de leur taille, la composition, ainsi que l&#39;abondance relative. Exécutée comme une épreuve NAMOS, il offre également la possibilité de déterminer la stœchiométrie d&#39;une certaine MPC. Compte tenu de son applicabilité générale, cette technique est un outil très utile pour la caractérisation des PPM (Dekker, Müller et al 1996.); (Wittig et Schagger 2008); (Wagner, Rehling et al 2009.); (Wittig et Schagger 2009) .

blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates

Complexes multiprotéiques (PPM) jouent un rôle crucial dans la signalisation cellulaire, puisque la plupart des protéines peuvent être trouvés dans des complexes fonctionnels ou réglementaires avec d&#39;autres protéines (Sali, Glaeser et al. 2003). Ainsi, l&#39;étude des réseaux d&#39;interactions protéine-protéine requiert la caractérisation détaillée des PPM d&#39;acquérir une compréhension intégrative des fonctions des protéines et la réglementation. Pour l&#39;identification et l&#39;analyse, les PPM doivent être séparés dans des conditions natives. Dans cette vidéo, nous décrivons l&#39;analyse des PPM par le bleu électrophorèse en gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE). BN-PAGE est une technique qui permet la séparation des PPM dans une conformation native avec une résolution supérieure à celle offerte par filtration sur gel ou d&#39;ultracentrifugation de densité de sucrose, et est donc utile pour déterminer la taille MPC, la composition et l&#39;abondance relative (Schagger et Jagow 1991) ; (Schagger, Cramer et al, 1994).. Par cette méthode, les protéines sont séparées selon leur taille et la forme hydrodynamique dans une matrice de polyacrylamide. Ici, nous démontrons l&#39;analyse des PPM du total des lysats cellulaires, soulignant que la dialyse lysat est l&#39;étape cruciale pour faire BN-PAGE applicables à ces prélèvements biologiques. En utilisant une combinaison de la dimension et la dimension BN-première seconde SDS-PAGE, nous montrons que les PPM séparés par BN-PAGE peut être subdivisée en leurs constituants individuels par SDS-PAGE. Visualisation des composants MPC en cas de séparation du gel est réalisée par immunoblot standard. À titre d&#39;exemple pour l&#39;analyse des PPM par BN-PAGE, nous avons choisi le 19S bien caractérisés eucaryotes, 20S, 26S et de protéasomes.

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Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Dans cette vidéo, nous décrivons la caractérisation de complexes multiprotéiques (PPM) en bleu électrophorèse en gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE). Dans une première dimension, dialysées lysats cellulaires sont séparés par BN-PAGE pour identifier les PPM individuelle. Dans une deuxième dimension SDS-PAGE, PPM d&#39;intérêt sont subdivisées afin d&#39;analyser leurs électeurs par immunoblot.

Bleu d&#39;électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) pour l&#39;analyse des complexes multiprotéiques de lysats cellulaires

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

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