Name: blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates at JoVE.com

אנו מודים מיכאל Reth, הרמן Schägger, ומרגריטה קמאצ&#39;ו-קארוואחאל תמיכה מדעית. עבודה זו מומנה על ידי FORSYS מן fuer Bundesministerium Bildung ו Forschung (BMBF), על ידי BIOSS מן Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), ו נתמך בחלקו על ידי יוזמת מצוינות של ממשלות פדרליות ואת המדינה הגרמנית (GSC-4, Spemann בית הספר למוסמכים ).

<ol>
	<li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer:+identification+of+three+dimer-specific+subunits.">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells.">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li><li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+words+to+literature+in+structural+proteomics.">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li><li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li><li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response.">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li><li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor.">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li><li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+(NAMOS-assay)+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes.">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li><li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis.">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

במחקר זה, אנו מתארים את הניתוח של MPCs ידי-BN. גישה 2D משמש MPCs נפרד הראשון תחת תנאים מקומיים, ולאחר מכן להמשיך לסעף אותם רכיבים בודדים שלהם מימד שנייה SDS-PAGE. דוגמאות מוכנים lysates מן התא. עבור solubilization של MPCs רבים, חומרי ניקוי מתאים נדרש, אשר שומרת על המבנה של קומפלקסים חלבונים. כאן, אנו משתמשים טריטון 0.1% X-100. עם זאת, חומר ניקוי אופטימלי ריכוז מתאים שלה צריך להיקבע באופן אמפירי לכל MPC. במקרה של טריטון X-100, למשל, זה כבר דווח כי ריכוזים נמוכים אבקת לאפשר זיהוי של צורה dimeric של F 1 F 0-ATPase מורכבות (ארנולד, פייפר et al. 1998). גבוהה טריטון X-100 ריכוזים, לעומת זאת, להוביל ניתוק של dimer ועל גידול מקביל של monomeric ה-F 1 F 0-ATPase מורכבים. זו עולה בקנה אחד עם המחקרים הקודמים שלנו, היינו מראים כי מורכבות multivalent T-cell receptor (TCR) נשמר בעת חילוץ עם ריכוזים נמוכים של Brij 96, ואילו את השימוש של ריכוז גבוה של חומר ניקוי או אחרת בשם התוצאות digitonin ב מיצוי של monomeric TCR (Schamel, Arechaga et al. 2005). דטרגנטים בשימוש נפוץ שניתן לבדוק כוללים digitonin (0.5-1%), טריטון X-100 (0.1-0.5%), Brij 96 (0.1-0.5%), או dodecylmaltoside (0.1-0.5%). ריאגנטים אלה הם חומרי ניקוי nonionic, אשר נוטים להיות הטוב ביותר עבור יציבות MPC. להיות מודעים לכך קשר עם SDS וחומרי ניקוי חזקים אחרים יש להימנע (קמאצ&#39;ו-קארוואחאל, Wollscheid et al. 2004). דיאליזה של lysates נדרש כדי להשיג הפרדה MPC בתוך הג&#39;ל-BN (קמאצ&#39;ו-קארוואחאל, Wollscheid et al 2004).; (Heiss, Junkes et al 2005).. נראה כי התאמה של ריכוז מלח או הסרת זיהומים נמוך משקל מולקולרי הוא קריטי עבור ברזולוציה גבוהה. ראוי לציין כי גם ההכנות הממברנה MPCs, אשר היו immunopurified ו eluted מאוחר יותר מן הנוגדן, מתאימים PAGE-BN (סוואמי, Siegers et al. 2006). בשני המקרים, הדגימות לא צריך להיות dialyzed להפרדה BN-PAGE, אם תמוגה קרום או elution מתבצעת חיץ BN-תמוגה. עבור הפרדה חלבון על ידי-BN, Coomassie את הצבע הכחול יש צורך, אשר נקשר לחלבונים unspecifically ומכסה אותם עם מטענים שליליים. ובכך, Coomassie כחול מאפשרת ניידות electrophoretic של חלבונים לכיוון הקתודה ב-pH נייטרלי (Schägger ו פון יגוב 1991); (Schägger, קריימר et al 1994).. יתר על כן, Coomassie כחול מונע הצטברות חלבון הג&#39;ל לערום במהלך אלקטרופורזה. עבור PAGE-BN, Coomassie G250 יש להשתמש במקום Coomassie כחול R250 או colloidal בלוז Coomassie. לפני הפעלת BN-ג&#39;ל, זה הכרחי על מנת להבטיח כי אחוז הג&#39;ל מתאים לגודל הצפוי של MPC של עניין. Precast BN-ג&#39;לים עם מילויים שונים מאגרים מתאימים זמינים מסחרית מן Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-טריס מערכת ג&#39;ל). אבל BN-ג&#39;לים יכול גם להיות מוכנים באמצעות מערבל צבע יחד עם משאבה persistaltic. כדי להבטיח שיפוע תקין, הנוזל צריך לזרום ללא הרף במהלך לשפוך ובועות יש להימנע. אנו ממליצים על הטעינה של דילולים מדגם שונה על הג&#39;ל מפני עומס יתר יכול להוביל משקעים חלבון בתהליך אלקטרופורזה. בנוסף, BN-ג&#39;לים יש לרוץ 4 ° C כדי למנוע פירוק חלבונים ולשמור MPCs ללא פגע. לאחר BN-PAGE, ויזואליזציה של MPCs ניתן להשיג על ידי מכתים Coomassie כחול מבריק, כסוף או מכתים immunoblotting. להקות חלבון דמיינו ידי מכתים Coomassie או כסף מתאימים לניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה (קמאצ&#39;ו-קארוואחאל, Wollscheid et al. 2004). במקרה של immunoblotting, תנאי ההעברה האופטימלי עבור MPCs העניין צריך להיקבע באופן אמפירי. שים לב Coomassie כחול מועבר גם במהלך סופג של ג&#39;ל-BN. לכן, ג&#39;ל יהיה חסר צבע לאחר העברת מוצלח, ואילו הממברנה יפעילו צבע כחול. יתר על כן, חשוב לציין כי לא כל נוגדן ראשוני, הפועלת לאיתור לאחר SDS-PAGE, הוא ישים immunoblotting על PAGE-BN. זה יכול לקרות כי הנוגדנים אינם מכירים MPC עניין כי epitope שלהם טמון קונפורמציה הילידים של החלבונים. כדי להתגבר על בעיה זו, אפשר לפגל את החלבונים בתוך הג&#39;ל-BN לפני ההעברה על ידי הרתחת ג&#39;ל בקרוב חיץ מדגם SDS 1x. בדוגמה שלנו, אנו לא הנושא BN-ג&#39;ל ישירות זיהוי של להקות חלבון. במקום זאת, אנו עוד חילקו את BN-PAGE מופרד lysate ידי dimensi secondעל SDS-PAGE. במימד השני SDS ג&#39;ל, חלבונים monomeric נודדים בתוך אלכסוני היפרבולי בשל הג&#39;ל הדרגתי במחצית הראשונה ואת ג&#39;ל ליניארי בממד השני (קמאצ&#39;ו-קארוואחאל, Wollscheid et al. 2004). זה מאפשר זיהוי קל של MPCs, שכן הם נקודתיים מתחת זה אלכסונית היפרבולי. המשנה ברורה של אחד MPC מופרדים בקו אנכי בממד השני SDS-PAGE. רכיבי כי הם המרכיבים של MPCs dinstinct כמה ניתן לזהות על קו אופקי בהתאם לגודל של MPC. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי מספר המקומות חלבון המופיע בשורה אחת אנכי יכול להיות גם חלק מתחמי נפרד להעביר בעמדה זהה PAGE-BN. ההוכחה הסופית שהם נמצאים MPC אותו ניתן להשיג על ידי נוגדן מבוססי assay משמרת ג&#39;ל. ב assay זה, lysate הסלולר הוא מודגרות עם נוגדן כנגד חלבון מיוצג על ידי אחד המקומות המזוהים לפני PAGE-BN. התוצאה היא שינוי של כל MPCs המכילים חלבון זה כלפי מסה מולקולרית גבוהה בממד הראשון. חלבונים אחרים הם גם חלק MPCs אלה יעברו שינוי זה מורכב ספציפיים ולכן הם קל לזהות בממד השני SDS ג&#39;ל. לא רק בהרכב MPCs ניתן לנתח על ידי-BN, אלא גם את הנחישות של stoichiometry שלהם הוא אפשרי (Schamel ו Reth 2000); (Schamel 2001), (סוואמי, Minguet et al 2007).. לענין זה, assay NAMOS (יליד נוגדן מבוססי assay ניידות במשמרת) יכולה להתבצע. כמו נוגדן מבוססי assay משמרת ג&#39;ל, lysates הסלולר מודגרת עם ספציפי למקטע נוגדנים חד שבטיים. זה מוביל אינדוקציה של immunoshifts electrophoretic ב BN-ג&#39;לים, המאפשרים היקש מן מידת השינוי על stoichiometry של MPCs ב conlusion, BN-PAGE מתאים לזיהוי MPCs וקביעת הרכב שלהם, הגודל, כמו גם השפע היחסי. בביצוע כמו assay NAMOS, היא מציעה גם את האפשרות לקבוע את stoichiometry של MPC מסוימים. לאור תחולתה הכללית שלה, טכניקה זו היא כלי מאוד שימושי לאפיון של MPCs (דקר, מולר ואח&#39; 1996.); (Wittig ו Schagger 2008); (וגנר, Rehling et al 2009).; (Wittig ו Schägger 2009) .

blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates

מתחמי multiprotein (MPCs) לשחק תפקיד מכריע האיתות בתא, מכיוון שרוב החלבונים ניתן למצוא מתחמי תפקודית או רגולטוריות עם חלבונים אחרים (סאלי, Glaeser et al. 2003). לכן, המחקר של חלבונים רשתות אינטראקציה מחייב אפיון מפורט של MPCs כדי להשיג הבנה אינטגרטיבית של תפקוד חלבונים תקנה. לצורך זיהוי וניתוח, MPCs יש להפריד בתנאים המקומיים. בסרטון זה, אנו מתארים את ניתוח MPCs ידי כחול ג&#39;ל אלקטרופורזה יליד polyacrylamide (BN-PAGE). BN-PAGE היא טכניקה המאפשרת הפרדה של MPCs ב קונפורמציה יליד עם רזולוציה גבוהה יותר המוצעים על ידי סינון ג&#39;ל או צפיפות ultracentrifugation סוכרוז, ולכן הוא שימושי כדי לקבוע את גודל MPC, קומפוזיציה, ואת השפע היחסי (Schägger ו פון יגוב 1991) ; (Schägger, קריימר et al 1994).. לפי שיטה זו, חלבונים מופרדים לפי גודל הידרודינמית שלהם ואת הצורה במטריצה ​​polyacrylamide. הנה, אנחנו מדגימים את ניתוח MPCs של lysates הסלולר הכולל, וציין כי דיאליזה lysate היא צעד חיוני כדי להפוך BN-PAGE החלים אלה דגימות ביולוגיות. באמצעות שילוב של PAGE-SDS BN-first ו המימד השני ממד, אנו מראים כי MPCs מופרדים על ידי-BN אפשר לחלק עוד יותר על ידי SDS-PAGE לתוך מרכיבי האישיות שלהם. ויזואליזציה של מרכיבי MPC על הפרדה בג&#39;ל מתבצע על ידי immunoblotting סטנדרטי. כדוגמה לניתוח MPC על ידי-BN, בחרנו 19S אוקריוטים היטב מאופיין, בשנות ה -20, ו proteasomes 26S.

Watch this Scientific Journal Video about Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates at JoVE.com

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

בסרטון זה, אנו מתארים את האפיון של מתחמי multiprotein (MPCs) על ידי כחול אלקטרופורזה בג&#39;ל יליד polyacrylamide (BN-PAGE). במימד ראשון, lysates הסלולר dialyzed מופרדים על ידי-BN לזהות MPCs בודדים. במימד השני SDS-PAGE, MPCs עניין מחולקים נוספת לנתח בוחריהם ידי immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה Gradient (DGGE)

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing polyacrylamide דשן ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

לשפוך והפעלה Gel חלבון על ידי שימוש חוזר קלטות מסחריים

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucin Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...