Name: blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00
Duration: 12 min 3 s
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我々は科学的なサポートのためにマイケルReth、ヘルマンSchägger、とマルガリータカマチョ-カルバハルに感謝する。この作品は、ドイツ学術振興協会（DFG）からのBIOSではによって、Bundesministerium福二BildungとForschung（BMBF）からFORSYSによって賄われ、ドイツ連邦政府と州政府のエクセレンスイニシアチブによって部分的にサポートされていました（GSC - 4、シュペーマン大学院）。

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利害の衝突は宣言されません。

本研究では、BN - PAGEによるMPCの分析について説明します。 2D的なアプローチは、ネイティブ条件下でまず個別のMPCに使用され、その後、さらに二次元目SDS - PAGEによって彼らの個々のコンポーネントにそれらを再分割する。 サンプルは、細胞ライセートから調製されています。多くのMPCの可溶化のために、適切な洗剤は、タンパク質複合体の構造は保存されますが、必要とされる。ここでは、0.1％トリトンX - 100を使用してください。しかし、最適な洗剤とその適切な濃度は、すべてのMPCのために経験的に決定する必要があります。トリトンX - 100の場合には、例えば、それは低い界面活性剤濃度は、F 1 F 0 - ATPaseの複合体（アーノルド、ファイファーら 1998）の二量体形態の識別を可能にすることが報告されている。高いトリトンX - 100濃度は、しかし、二量体の解離と単量体F 1 F 0 - ATPaseの複合体の対応する増加につながる。高濃度のまたは別の洗剤の使用量がINジギトニンの結果を呼ばれるのに対し、これは私たちのかつての研究の一つの線の上に、我々は、のBrij 96の低濃度で抽出するときに多価のT細胞受容体複合体（TCR）が保持されることを示していた単量体のTCRの抽出（Schamel、Arechaga ら、2005）。テストすることができる一般的に使用される洗剤は、ジギトニン（0.5〜1％）、トリトンX - 100（0.1〜0.5％）、のBrij 96（0.1〜0.5％）、またはdodecylmaltosideを（0.1〜0.5％）含まれています。これらの試薬は、MPCの安定のために最良になりがちな非イオン性界面活性剤、です。 SDSやその他の強力な洗剤との接触は（カマチョ-カルバハル、Wollscheid ら 2004）は避けるべきであることに注意してください。 溶解液の透析は、BN -ゲル（。カマチョ-カルバハル、Wollscheid ら 2004）でMPCの分離を達成するために必要とされ、（ハイス、Junkes ら、2005。）。それは、塩濃度または低分子量不純物の除去の調整は、高解像度のために重要であると思われる。また、免疫精製し、後で抗体から溶出されている膜調製物とMPCは、、（スワミー、Siegers ら 2006）BN - PAGEに適していることは注目に値する。どちらの場合も、サンプルは膜の溶解または溶出がBN -溶解緩衝液中で実施されている場合、BN - PAGEの分離のために透析する必要はありません。 BN - PAGEによるタンパク質の分離のために、色素クーマシーブルーは、タンパク質に非特異的に結合し、負電荷でそれらをカバーする、必要とされる。これにより、クマシーブルーでは、中性pH（SchäggerとフォンJagow 1991）で、陰極に向かって、タンパク質の電気泳動移動度を可能にします;（Schägger、クラマーら1994。）。さらに、クマシーブルーでは電気泳動中にスタッキングゲルにタンパク質の凝集を防ぎます。 BN - PAGEの場合は、クマシーG250は、クマシーブルーR250またはコロイドクマシーブルースの代わりに使用する必要があります。 BN -ゲルを実行する前に、それはゲルの割合は、関心のMPCの予想サイズに収まるようにするために必要です。さまざまなグラデーションと、適切なバッファを持つBN -ゲルはインビトロジェン（NativePAGE NOVEXビス - トリスゲルシステム）から市販されているプレキャスト。しかし、BN -ゲルはまたpersistalticポンプと一緒に勾配のミキサーを用いて調製することができる。無傷の勾配を保証するために、液体が注ぐ中に絶えず流れる必要があり、気泡は避けてください。オーバーロードは、電気泳動プロセス中にタンパク質沈殿する可能性があるため私たちは、ゲル上の異なるサンプルの希釈のロードをお勧めします。さらに、BN -ゲルは4℃で実行する必要があります° Cは、タンパク質の分解を防止するとMPCがそのまま保持する。 MPCはのBN - PAGE、可視化は、クマシーブリリアントブルー染色、銀染色やイムノブロッティングによって達成することができます後。タンパク質バンドはクーマシーまたは銀染色により可視化質量分析法（カマチョ-カルバハル、Wollscheid ら 2004）によるさらなる分析に適しています。イムノブロットの場合には、関心のMPCのための最適な転送条件は、経験的に決定する必要があります。クマシーブルーでもBN -ゲルからブロッティング中に転送されていることに注意してください。したがって、ゲル、膜は青色を発揮するのに対し、転送が成功すると無色になります。さらに、SDS - PAGE後の検出のために働くしないすべての一次抗体は、、BN - PAGEによりイムノブロットに適用可能であることを言及することが重要です。それは彼らのエピトープは、タンパク質の天然構造に隠されているため、抗体は興味のMPCを認識しないことが起こり得ます。この問題を克服するために、それは1x SDSサンプルバッファーでまもなくゲルを煮沸することにより前の転送へのBN -ゲル内のタンパク質を変性させることが可能です。 この例では、我々は、タンパク質バンドの検出に直接BN -ゲルを衝撃はなかった。その代わりに、我々は、第2 dimensiによってBN - PAGEで区切られたライセートを分けるSDS - PAGE上で。二次元SDS -ゲルでは、単量体蛋白質は第1および第2の次元（カマチョ-カルバハル、Wollscheid ら 2004）の線形ゲルの濃度勾配ゲルによる双曲線角内に移行する。彼らはこの双曲線対角線の下にローカライズされているので、これは、MPCのを簡単に識別することができます。 1つの異なるMPCのサブコンポーネントは、二次元SDS - PAGEの縦線で区切られています。いくつかのdinstinctのMPCはの構成要素であるコンポーネントは、MPCの大きさに応じて水平線を識別することができます。しかし、それを垂直方向に1行に現れるいくつかのタンパク質のスポットがまたBN - PAGEで同じ位置に移行する独立した複合体の一部であることを考慮する必要があります。彼らは同じMPC内に存在すること、最終的な証拠は抗体ベースのゲルシフトアッセイによって得ることができます。このアッセイでは、細胞溶解物は、前のBN - PAGEに同定されたスポットの一つで表されるタンパク質に対する抗体とともにインキュベートされる。最初の次元の高い分子量の方にこのタンパク質を含むすべてのMPCのシフトでこの結果。また、これらのMPCの一部である他のタンパク質は、この複雑な固有のシフトを受けるため、二次元目SDS -ゲルで簡単に識別できるでしょう。 MPCはの組成はBN - PAGEで分析だけでなく、それらの化学量論の決定が可能です（SchamelとReth 2000）することができるだけではなく、（Schamel 2001）、（スワミー、Minguet ら2007）。この目的のために、NAMOSアッセイ（ネイティブ抗体ベースの移動度シフトアッセイ）を行うことができます。抗体ベースのゲルシフトアッセイと同様に、細胞溶解物は、モノクローナルサブユニット特異的抗体とインキュベートされています。これは、MPCは化学量論にシフトの程度から推論を可能にするBN -ゲルで電気泳動immunoshiftsの誘導につながる conlusionでは、BN - PAGEは、MPCはの同定とそれらのサイズ、組成だけでなく、相対的な豊かさの測定に適しています。 NAMOSアッセイとして実行、それはまた、特定のMPCの化学量論を決定する可能性を提供しています。その一般的な適用を考えると、このテクニックは、MPCはの特性評価（。デッカー、ミュラーら 1996）は非常に有益なツールです、（ウィッティッヒとSchagger 2008）;（ワーグナー、Rehling ら2009。）、（ウィッティッヒとSchägger 2009） 。

blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates

ほとんどのタンパク質が他のタンパク質と機能的または規制上の複合体（サリ、Glaeser ら、2003）で見つけることができるので、多タンパク質複合体（MPCは）、細胞シグナル伝達において重要な役割を果たしている。従って、タンパク質 - タンパク質相互作用ネットワークの研究は、タンパク質の機能や制御の統合的な理解を得るためのMPCの詳細な特性評価が必要になります。識別と分析のために、MPCは、ネイティブ条件下で区切る必要があります。このビデオでは、我々は青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN - PAGE）でのMPCの分析について説明します。 BN - PAGE、ゲル濾過やショ糖密度遠心分離によって提供されるよりも高い解像度で本来のコンフォメーションでのMPCの分離を可能にする技術であり、そしてMPCのサイズ、組成、および相対量（SchäggerとフォンJagow 1991）を決定するために有用です。 ;（Schägger、クラマーら1994。）。この方法によって、タンパク質は、ポリアクリルアミドのマトリックスで、その流体力学的サイズと形状に応じて分離されています。ここで、我々は、ライセート透析は、BN - PAGEこれらの生物学的試料に適用するために重要なステップであることを指摘し、全細胞溶解液ののMPCの分析を示しています。最初の次元BN -および二次元目SDS - PAGEの組み合わせを使用して、我々は、BN - PAGEによって分離MPCは、さらにSDS - PAGEによって彼らの個々の成分に分割することができることを示している。ゲルの分離時にMPCのコンポーネントの可視化は、標準的な免疫ブロッティングにより実行されます。 BN - PAGEによるMPCの解析の例として、我々は十分に特徴付け真核生物の19S、20S、および26Sプロテアソームを選んだ。

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Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

このビデオでは、我々は青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN - PAGE）により、多タンパク質複合体（MPCは）の特性について説明します。最初の次元では、透析の細胞溶解物を、個々のMPCを識別するために、BN - PAGEによって分離される。二次元目SDS - PAGEにおいては、関心のMPCは、さらに免疫ブロッティングにより、その成分を分析するために細分化されています。

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Research

JoVE Journal

Biology

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

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