Name: blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00
Duration: 12 min 3 s
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우리는 마이클 Reth, 헤르만 Schägger와 마가리타 과학 지원 카마초 - Carvajal 감사합니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에서 BIOSS하여 Bundesministerium fuer Bildung 및 Forschung (BMBF)에서 FO​​RSYS에 의해 재정 지원하고, 독일 연방 및 주 정부의 우수 이니셔티브 (GSC - 4, Spemann 대학원에서 일부 지원이 ).

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

본 연구에서는, 우리는 BN - PAGE에 의해 MPCs의 분석을 설명합니다. 2D 접근이 기본 조건 첫째 별도 MPCs하는 데 사용됩니다, 그리고 추가로 두 번째 차원 SDS - PAGE하여 개별 구성 요소로 그들을 나눌 수 있습니다. 샘플은 세포 lysates의 준비가되어 있습니다. 많은 MPCs의 solubilization 들어, 적절한 세제는 단백질 단지의 구조를 유지하는, 필요합니다. 여기, 우리는 0.1 % 트리톤 X - 100을 사용합니다. 그러나, 최적의 세제와 적당한 농도는 모든 MPC에 대해 경험적으로 결정해야합니다. 의 경우에는 트리톤 X - 100, 예를 들면, 그것은 낮은 세제 농도가 F 1 dimeric 양식의 식별을 허용되는 것으로보고되었습니다 F 0 - ATPase 복합 (아놀드, 파이퍼 외. 1998). 높은 트리톤 X - 100 농도는하지만, 이합체의 분리와 monomeric F 1 F 0 - ATPase 복합 해당 증가로 이어집니다. 높은 농도 또는 다른 세제의 사용가 digitonin 결과를 불리는 반면, 이것은 과거의 연구 중 하나와 라인에, 우리는 Brij 96 낮은 농도로 추출하면 multivalent T - 세포 수용체 복합 (TCR)가 보존는 것을 보여주고 있었다 monomeric TCR의 추출 (Schamel, Arechaga 외. 2005). 테스트할 수 있습니다 일반적으로 사용되는 세제는 digitonin (0.5-1 %), 트리톤 X - 100 (0.1-0.5 %), Brij 96 (0.1-0.5 %), 또는 dodecylmaltoside을 (0.1-0.5 %) 등이 있습니다. 이 시약은 MPC의 안정성을 위해 최선이 될 경향이 nonionic 세제입니다. SDS와 다른 강한 세제과 접촉이 (카마초 - Carvajal, Wollscheid 외. 2004) 피해야한다고 알고 있습니다. lysates의 투석은 BN - 젤의 MPC 분리 (. 카마초 - Carvajal, Wollscheid 외 2004) 달성하는 데 필요한, (Heiss, Junkes 외 2005.). 그것은 소금 농도 또는 낮은 분자량의 불순물의 제거의 조정은 높은 해상도를 위해 중요 것 같습니다. 또한 immunopurified 나중에 항체에서 eluted되었습니다 막 준비와 MPCs이 (스와미, Siegers 외. 2006) BN - PAGE에 적합한 것을 주목할만한 것입니다. 두 경우 모두에서, 샘플은 멤브레인 용해 또는 용출이 BN - 용해 버퍼에서 실시하는 경우, BN - PAGE 분리에 대한 dialyzed 될 필요가 없습니다. BN - PAGE로 단백질 분리, 염료 쿠매시 파란색 단백질 unspecifically 바인딩과 부정 청구와 ​​함께 그들을 포함하는, 필요합니다. 따라서, 쿠매시 파란색 중립 PH (Schägger 및 본 Jagow 1991)에서 음극쪽으로 단백질의 전기 영 동적 이동성을 가능하게, (Schägger, 크래머 외 1994.). 또한, 쿠매시 파란색 전기 영동하는 동안 쌓아 겔의 단백질 집합을 방지합니다. BN - PAGE 들어, 쿠매시 G250은 쿠매시 청색 R250이나 콜로이드 쿠매시 블루스 대신 사용할 수 있습니다. BN - 젤을 실행하기 전에, 그것은 젤의 비율은 관심의 MPC의 예상 크기에 맞는 것을 보장하기 위해 필요합니다. 다양한 그라디언트와 적절한 버퍼 Invitrogen (NativePAGE Novex BIS - 트리스 젤 시스템)에서 상업적으로 사용할 수로 BN - 젤을 프리 캐스트. 그러나 BN - 젤 또한 persistaltic 펌프와 함께 그라디언트 믹서를 사용하여 준비하실 수 있습니다. 손상 그라데이션을 보장하기 위해 액체가 쏟아져과 거품을 피해야한다 동안 끊임없이 유동한다. 과부하가 전기 과정 중에 단백질 침전으로 이어질 수 있기 때문에 우리는 겔에 다른 샘플 dilutions의 로딩을 권장합니다. 또한, BN - 젤은 4 실행되어야 ° C 단백질 저하를 방지하고 MPCs 그대로 유지합니다. MPCs의 BN - PAGE, 시각화가 쿠매시 빛나는 푸른 얼룩, 실버 얼룩이나 immunoblotting하여 얻을 수있다 후에. 단백질 밴드 대량 분석계 (카마초 - Carvajal, Wollscheid 외. 2004)에 의해 더 분석에 적합합니다 쿠매시 또는 실버 얼룩의 시각. immunoblotting의 경우 관심의 MPCs에 대한 최적의 전송 상태는 경험적으로 결정해야합니다. 쿠매시 블루도 BN - 젤의 모래 바닥 동안 전송되는 점에 유의하십시오. 막이 파란 색깔을 발휘합니다 반면 따라서, 젤은 성공적인 전송 후에 무색됩니다. 또한, SDS - PAGE 후 검색을 위해 일하는 게 아니 모든 기본 항체가, BN - PAGE에 immunoblotting에 적용할 수 있다고 언급하는 것이 중요합니다. 그것은 그들의 에피토프이 단백질의 원래 형태에 숨겨져 있기 때문에 항체가 관심의 MPC를 인식하지 않는 것이 발생할 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해서는 1X SDS 샘플 버퍼에 곧 젤 끓는 사전 전송 BN - 겔 내에서 단백질을 변성 수 있습니다. 우리의 예제에서는, 우리는 단백질 밴드의 검출에 직접 BN - 젤 적용되지 않았다. 대신, 우리는 추가로 두 번째 dimensi하여 BN - PAGE로 구분 lysate를 나누어SDS - PAGE에. 두 번째 차원 SDS - 겔에서 monomeric 단백질은 두 번째 차원 (카마초 - Carvajal, Wollscheid 외. 2004)의 첫 번째와 선형 겔에서 그라디언트 젤로 인해 쌍곡선 대각선 이내에 마이 그 레이션. 그들이 쌍곡선 대각선 아래화된되기 때문에 이것은, MPCs의 쉽게 확인하실 수 있습니다. 한 별개의 MPC의 하위 구성 요소는 두 번째 차원 SDS - PAGE의 수직선에서 구분됩니다. 여러 dinstinct의 MPCs의 성분 구성 요소는 MPC의 크기에 따라 수평선에서 확인할 수 있습니다. 그러나, 하나의 수직선에 나타나는 여러 가지 단백질의 명소도 BN - PAGE의 동일한 위치에서 마이 그 레이션 개별 단지의 일부가 될 수 있다고 간주되어야한다. 그들은 같은 MPC에 나타날 수있는 마지막 증거는 항체 기반 겔 변화 분석에 의해 얻을 수 있습니다. 이 분석에서는 셀룰러 lysate 전에 BN - PAGE로 확인 명소 중 하나에 의해 대표되는 단백질에 대한 항체와 함께 incubated입니다. 첫 번째 차원 높은 분자 질량으로이 단백질을 포함하는 모든 MPCs의 변화이 발생합니다. 이러한 MPCs의 일부 다른 단백질이 복잡한 특정 변화를 받아야하므로 두 번째 차원 SDS - 겔에서 식별하는 쉬운 것입니다. 뿐만 아니라 MPCs의 구성은 BN - PAGE로 분석뿐만 아니라 자신의 stoichiometry의 결정은 (Schamel 및 Reth 2000) 수도 수 있으며 (Schamel 2001), (스와미, Minguet 외 2007.). 이를 위해 NAMOS 분석 (기본 항체 기반 이동성 교대 분석)을 수행할 수 있습니다. 항체 기반 겔 변화 분석에서와 마찬가지로, 세포 lysates은 단클론 subunit 특정 항체와 incubated 있습니다. 이것은 MPCs의 stoichiometry에있는 변화의 범위에서 추론을 허용 BN - 젤에서 전기 immunoshifts의 유도에 연결 conlusion에서 BN - PAGE은 MPCs의 식별과 크기, 구성뿐만 아니라, 상대 풍요의 결정에 적합합니다. NAMOS 분석으로 수행, 그것은 또한 특정 MPC의 stoichiometry을 결정할 수있는 가능성을 제공합니다. 의 일반적인 적용을 감안할 때,이 기법은 MPCs의 특성 (. 데커, 뮐러 외 1996)에 대한 매우 유용한 도구입니다, (위티그 및 Schagger 2008), (바그너, Rehling 외 2009)., (위티그 및 Schägger 2009) .

blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates

대부분의 단백질이 다른 단백질과 기능이나 규제 단지 (살리, Glaeser 외. 2003)에서 찾을 수 있으므로 Multiprotein의 단지 (MPCs)은 세포 신호 전달에 중요한 역할을한다. 따라서, 단백질 - 단백질 상호 작용 네트워크의 연구는 단백질 기능과 규정의 통합 이해를 얻을 수 MPCs의 세부 특성이 필요합니다. 식별 및 분석을 위해, MPCs는 기본 조건 구분해야합니다. 이 비디오에서는, 우리는 푸른 원시의 polyacrylamide 겔 전기 영동 (BN - PAGE)에 의해 MPCs의 분석을 설명합니다. BN - PAGE은 젤 여과 또는 자당 밀도 ultracentrifugation에 의해 제공되는보다 높은 해상도와 고유의 형태에 MPCs의 분리를 허용하고, MPC 크기, 구성, 그리고 상대적으로 풍부 (Schägger 및 본 Jagow 1991)를 결정하는 것이 유용합니다 기술입니다 ; (Schägger, 크래머 외 1994.). 이 방법으로 단백질들은 유체 크기와 polyacrylamide의 매트릭스에 형태에 따라 구분됩니다. 여기, 우리는 lysate 투석은 BN - PAGE 이러한 생물 학적 샘플에 적용을하는 중요한 단계입니다 지적, 전체 세포 lysates의 MPCs의 분석을 보여줍니다. 첫째 차원 BN -와 두 번째 차원 SDS - PAGE의 조합을 사용하여, 우리는 BN - PAGE로 구분 MPCs이 더욱 SDS - PAGE에 의해 그들의 개인적인 성분으로 세분화 될 수 보여줍니다. 겔 분리시 MPC 구성 요소의 시각화 표준 immunoblotting에 의해 수행됩니다. BN - PAGE에 의해 MPC 분석을위한 예를 들어, 우리는 잘 특징 진핵세포 19S, 20 대, 그리고 26S proteasomes를 선택했습니다.

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Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

이 비디오에서는, 우리는 푸른 원시의 polyacrylamide 겔 전기 영동 (BN - PAGE)에 의해 multiprotein의 단지 (MPCs)의 특성을 설명합니다. 첫 번째 차원에서 dialyzed 세포 lysates은 개별 MPCs을 식별할 BN - PAGE로 구분됩니다. 두 번째 차원 SDS - PAGE에 관심 MPCs은 더욱 immunoblotting하여 성분을 분석하기 위해 세분화됩니다.

셀룰러 Lysates에서 Multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE)

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Research

JoVE Journal

Biology

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