Name: blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates at JoVE.com

Мы благодарим Майкла Reth, Герман Schägger, и Маргарита Камачо Карвахаль для научной поддержки. Эта работа финансировалась из FORSYS Bundesministerium Fuer Bildung и Forschung (BMBF), по БИОСС из Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), а также при частичной поддержке совершенства Инициатива немецкого федерального правительства и правительств (ГСК-4, Спеманн Высшая школа ).

<ol>
	<li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer:+identification+of+three+dimer-specific+subunits.">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells.">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li><li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+words+to+literature+in+structural+proteomics.">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li><li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li><li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response.">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li><li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor.">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li><li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+(NAMOS-assay)+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes.">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li><li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis.">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

В этом исследовании мы опишем анализ ПДК по БН-PAGE. 2D подход используется для первого отдельного ПДК в нативных условиях, а затем в дальнейшем разделить их на отдельные компоненты, второе измерение SDS-PAGE. Образцы готовят из клеточных лизатов. Для растворения многих ПДК, соответствующих моющих средств необходимо, который сохраняет структуру белковых комплексов. Здесь мы используем 0,1% Тритон Х-100. Однако, оптимальное моющее средство и его подходящей концентрации должны быть определены эмпирически для каждого ПДК. В случае Тритон Х-100, например, было сообщено, что низкие концентрации моющего средства позволяют выявлять димерных форм F 1 F 0-АТФазы комплекса (Арнольд, Пфайфер и соавт. 1998). Высшее Тритон Х-100 концентрациях, однако, привести к диссоциации димера и соответствующее увеличение мономерных F 1 F 0-АТФазы комплекса. Это согласуется с одним из наших бывших исследования, были мы покажем, что поливалентные Т-клеточного рецептора комплекса (TCR) сохраняется после извлечения с низкой концентрацией Brij 96, в то время как использование более высокой концентрации или другого моющего средства называются дигитонин результаты в извлечение мономерных TCR (Schamel, Аречаги и соавт. 2005). Часто используемые моющие средства, которые могут быть проверены включают дигитонин (от 0,5 до 1%), Тритон Х-100 (от 0,1 до 0,5%), Бридж 96 (от 0,1 до 0,5%), или dodecylmaltoside (от 0,1 до 0,5%). Эти реагенты неионогенные моющие средства, которые имеют тенденцию быть лучше для стабильности ПДК. Имейте в виду, что контакт с СДС и другие сильные моющие средства следует избегать (Камачо Карвахаль, Wollscheid и соавт. 2004). Диализ лизатов является необходимой для достижения ПДК разделения в БН-гель (Камачо Карвахаль, Wollscheid и др. 2004 год.); (Хайс, Junkes и др. 2005).. Кажется, что корректировка концентрации соли или удаления низкомолекулярных примесей вес имеет решающее значение для высокого разрешения. Стоит отметить, что также мембранные препараты и ПДК, которые были immunopurified а позже вымывают из антител, пригодных для БН-PAGE (Свами, Siegers и соавт. 2006). В обоих случаях образцы не должны быть диализу для БН-PAGE разделения, если лизис мембраны или элюирования осуществляется в БН-лизис буфера. Для разделения белков по БН-PAGE, краситель синий Кумасси необходима, который связывается с белками неспецифичным и покрывает их с отрицательными зарядами. Таким образом, Кумасси синим позволяет электрофоретической подвижности белков к катоду при нейтральном рН (Schägger и фон Jagow 1991); (Schägger, Крамер и др., 1994.). Кроме того, Кумасси синий препятствует агрегации белков в концентрирующий гель во время электрофореза. Для БН-PAGE, Кумасси G250 должен быть использован вместо Кумасси синий R250 или коллоидной блюз Кумасси. Перед запуском БН-гель, необходимо, чтобы процент гель подходит для ожидаемого размера ПДК интерес. Сборный БН-гели с различными градиентами и подходящих буферов являются коммерчески доступными из Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Гель System). Но БН-гели могут быть также получены с использованием градиента смеситель вместе с persistaltic насоса. Чтобы гарантировать нетронутыми градиент, жидкость должна поступать постоянно при разливке и пузыри следует избегать. Мы рекомендуем загрузку различных разведений образца на гель потому что перегрузка может привести к осаждения белка во время электрофореза процесса. Кроме того, БН-гели должны быть запущены при 4 ° С для предотвращения деградации белка и держать ПДК нетронутыми. После БН-PAGE, визуализация ПДК может быть достигнуто путем Кумасси бриллиантовый синий окрашивания, окрашивания серебром или иммуноблоттинга. Белки полосы визуализировали окрашиванием Кумасси или серебро являются подходящими для дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии (Камачо Карвахаль, Wollscheid и соавт. 2004). В случае иммуноблоттинга, оптимальные условия для передачи ПДК интереса должны быть определены опытным путем. Помните, что Кумасси синий также передается во время блоттинга БН-гель. Таким образом, гель будет бесцветным после успешной передачи, в то время как мембрана будет оказывать синего цвета. Кроме того, важно отметить, что не каждое первичное антитело, которое работает для обнаружения после SDS-PAGE, применимо к иммуноблоттинга на БН-PAGE. Это может случиться, что антитела не признают ПДК интерес, потому что их эпитопа скрыт в родной конформации белков. Чтобы преодолеть эту проблему, можно для денатурации белков в БН-гель до передачи в кипящей геля в скором времени в 1х буфере образец SDS. В нашем примере, мы не предмет БН-гель непосредственно на обнаружение белка полосы. Вместо этого, мы разделены БН-PAGE разделенных лизат вторым dimensiна SDS-PAGE. Во втором измерении SDS-гель, мономерные белки мигрировать в гиперболической диагональные связи с градиентом геля в первом и линейного геля во втором измерении (Камачо Карвахаль, Wollscheid и соавт. 2004). Это позволяет легко идентифицировать ПДК, так как они локализованы ниже этой гиперболической диагонали. Подкомпоненты одно определенное MPC разделяются в вертикальную линию во втором измерении SDS-PAGE. Компоненты, которые входят в состав нескольких ПДК dinstinct может быть идентифицирован по горизонтальной линии в соответствии с размером ПДК. Тем не менее, он должен учитывать, что несколько мест белков, входящих в одной вертикальной линии может также быть частью отдельных комплексов, которые мигрируют на той же позиции в БН-PAGE. Окончательное доказательство того, что они находятся в том же MPC может быть получена на основе антител методом сдвига геля. В данном анализе сотовой лизат инкубировали с антителами против белка представлен одним из выявленных пятна до БН-PAGE. Это приводит к сдвигу всех ПДК, которые содержат этот белок в направлении более высокой молекулярной массы в первом измерении. Другие белки, которые также являются частью этих ПДК будет проходить этот комплекс конкретных сдвига и, следовательно, легко определить, во втором измерении SDS-гель. Не только состав ПДК могут быть проанализированы БН-страницы, но также определение их стехиометрии можно (и Schamel Reth 2000); (Schamel 2001), (Свами, Minguet и др. 2007 год.). Для этого анализа Namos (родной основе антител мобильности сдвига анализ) может быть выполнена. Как и в основе антител методом сдвига геля, сотовые лизатов инкубировали с моноклональными субъединицы-специфических антител. Это приводит к индукции электрофоретического immunoshifts в БН-гели, которые позволяют вывод из степени переложить на стехиометрии ПДК В conlusion, БН-страница предназначена для определения ПДК и определение их размера, состава, а также относительное изобилие. Исполняется как анализ Namos, он также предлагает возможность определения стехиометрии определенных ПДК. С учетом его общего применения, этот метод является очень полезным инструментом для характеристики ПДК (Деккер, Мюллер и др., 1996.); (Виттиг и Schagger 2008); (Вагнер, Rehling и др. 2009 год.); (Виттиг и Schägger 2009) .

blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates

Multiprotein комплексов (ПДК) играют важную роль в клеточной сигнализации, так как большинство белков может быть найден в функциональном или нормативных комплексов с другими белками (Сали, Glaeser и соавт. 2003). Таким образом, исследования белок-белковых взаимодействий сетей требует детальной характеристики ПДК, чтобы получить понимание интегративной функции белка и регулирования. Для идентификации и анализа, ПДК должны быть разделены по родной условиях. В этом видео мы описываем анализ ПДК синим родной электрофореза в полиакриламидном геле (БН-PAGE). БН-страница представляет собой метод, который позволяет разделение ПДК в нативной конформации с высоким разрешением, чем предлагаемые гель-фильтрации или центрифугирования плотности сахарозы, и поэтому полезен для определения ПДК размер, состав и относительное изобилие (Schägger и фон Jagow 1991) ; (Schägger, Крамер и др., 1994.). С помощью этого метода, белки разделяются в зависимости от их гидродинамические размеры и форму в полиакриламидном матрицы. Здесь мы демонстрируем анализ ПДК от общего числа сотовых лизатов, указывая, что лизат диализ решающий шаг, чтобы сделать БН-СТРАНИЦА, применимых к этим биологическим образцам. Используя комбинацию первого измерения БН-и второе измерение SDS-PAGE, мы покажем, что ПДК, разделенных БН-страница может быть далее подразделены на их отдельных компонентов на SDS-PAGE. Визуализация компонентов ПДК на гель разделение осуществляется стандартным иммуноблоттинга. В качестве примера для MPC анализа БН-страницу, мы выбрали хорошо известных эукариотических 19S, 20S, 26S и протеасом.

Watch this Scientific Journal Video about Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates at JoVE.com

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

В этом видео мы описываем характеристики multiprotein комплексов (ПДК) синим родной электрофореза в полиакриламидном геле (БН-PAGE). В первом измерении, диализовали сотовой лизатов разделены БН-PAGE для идентификации отдельных ПДК. В втором измерении SDS-PAGE, ПДК интерес в свою очередь подразделяются для анализа своих избирателей с помощью метода иммуноблоттинга.

Синий Родные электрофореза в полиакриламидном геле (BN-PAGE) для анализа Multiprotein Комплексы из ячеистого Лизаты

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Денатурирующих Электрофорез Градиент гель (DGGE)

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Скрининг на агрегации амилоида по Полу-денатурирующих моюще-электрофореза в агарозном геле

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Идентификация белковых комплексов с количественной протеомики в CEREVISIAE С.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Денатурирующих Мочевина полиакриламидном геле (мочевина PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Заливка и запуск Белки гель за счет повторного использования коммерческих Кассеты

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Агарозном геле для разделения фрагментов ДНК

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

Новый подход к сравнительному анализу мультибелковых комплексов на основе<sup&gt; 15</sup&gt; N Метаболический Маркировка и количественный Масс-спектрометрия

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

АСМ на основе карт из упругих свойств клеточных стенок: на ткани, клеточном, и субклеточных резолюций

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Муцин Электрофорез в агарозном геле: Вестерн блот для высокой молекулярной массой гликопротеинов


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...