Name: blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00
Duration: 12 min 3 s
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Damos las gracias a Michael Reth, Schagger Hermann, y Margarita Camacho-Carvajal de apoyo científico. Este trabajo fue financiado por FORSYS de la Bildung Bundesministerium fuer Forschung y de Alemania (BMBF), por el BIOS de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), y apoyado en parte por la Iniciativa de Excelencia de los Gobiernos de Alemania Federal y el Estado (GSC-4, Spemann Escuela de Posgrado ).

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	<li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer:+identification+of+three+dimer-specific+subunits.">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells.">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li><li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+words+to+literature+in+structural+proteomics.">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li><li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li><li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response.">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li><li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor.">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li><li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+(NAMOS-assay)+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes.">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li><li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis.">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li></ol>

En este estudio, se describe el análisis de los países socios mediterráneos por BN-PAGE. Un enfoque en 2D se utiliza para separar los PSM primera virtud de las condiciones, y luego más que dividir en sus componentes individuales de una segunda dimensión SDS-PAGE. Las muestras se preparan a partir de lisados ​​celulares. Para la solubilización de muchos países socios mediterráneos, un detergente apropiado que se necesita, que conserva la estructura de los complejos de proteínas. Aquí, nosotros usamos un 0,1% Triton X-100. Sin embargo, el detergente óptimo y su concentración adecuada tiene que ser determinada empíricamente para cada MPC. En el caso de Triton X-100, por ejemplo, se ha informado de que las bajas concentraciones de detergente permite la identificación de una forma dimérica de la F 1 F 0-ATPasa complejos (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Mayor Triton X-100 concentraciones, sin embargo, a la disociación del dímero y el correspondiente aumento de las monoméricas F 1 F 0-ATPasa complejo. Esto está en consonancia con uno de nuestros estudios anteriores, se nos muestran que el polivalente de células T complejo receptor (TCR) se conserva cuando se extrae con bajas concentraciones de Brij 96, mientras que el uso de una mayor concentración o de otro detergente llamado digitonina resultados en la extracción de monómero TCR (Schamel, Arechaga y cols. 2005). Detergentes de uso común que pueden ser probados incluyen digitonina (0,5 a 1%), Triton X-100 (0,1 a 0,5%), Brij 96 (de 0,1 a 0,5%), o dodecylmaltoside (0,1 a 0,5%). Estos reactivos son los detergentes no iónicos, que tienden a ser mejor para la estabilidad de MPC. Tenga en cuenta que el contacto con SDS y otros detergentes fuertes se debe evitar (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Diálisis de los lisados ​​se requiere para lograr la separación MPC en un BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004).; (Heiss, Junkes et al 2005).. Parece que el ajuste de la concentración de sal o la eliminación de las impurezas de bajo peso molecular es crucial para alta resolución. Es de destacar que también las preparaciones de membrana y los PSM, que han sido inmunopurificados y posteriormente eluido de los anticuerpos, son adecuados para BN-PAGE (Swamy, Siegers et al. 2006). En ambos casos, las muestras no tienen que ser dializados para la separación de BN-PAGE, si la lisis de membrana o de elución se lleva a cabo en tampón BN-lisis. Para la separación de proteínas por BN-PAGE, el colorante azul de Coomassie es necesario, que se une inespecíficamente a las proteínas y los cubre con las cargas negativas. De esta manera, azul de Coomassie permite la movilidad electroforética de las proteínas hacia el cátodo a un pH neutro (Schagger y von Jagow 1991); (Schagger, Cramer et al, 1994).. Además, azul de Coomassie impide la agregación de proteínas en el gel de apilamiento durante la electroforesis. BN-PAGE, Coomassie G250 tiene que ser usado en lugar de azul de Coomassie R250 o coloidal azul Coomassie. Antes de ejecutar un BN-gel, es necesario garantizar que el porcentaje del gel se adapta al tamaño esperado de la MPC de interés. Prefabricados BN-geles con gradientes de diferentes tampones adecuados y están disponibles comercialmente a partir de Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Sin embargo, BN-geles también pueden prepararse usando un mezclador de gradiente, junto con una bomba persistaltic. Para garantizar un gradiente intacta, el líquido debe fluir constantemente durante el vaciado y las burbujas se debe evitar. Recomendamos la carga de las diluciones de muestras diferentes en el gel, porque la sobrecarga puede dar lugar a la precipitación de proteínas durante el proceso de electroforesis. Además, el BN-geles se debe ejecutar a 4 ° C para evitar la degradación de proteínas y para mantener el PSM intacto. Después de BN-PAGE, la visualización de los PSM se puede lograr mediante la tinción de azul brillante de Coomassie, tinción de plata o inmunotransferencia. Las bandas de proteínas visualizados por tinción con Coomassie o plata son adecuados para su posterior análisis por espectrometría de masas (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). En el caso de inmunotransferencia, las condiciones de transferencia óptima de los países socios mediterráneos de interés tiene que ser determinada empíricamente. Tenga en cuenta que Coomassie azul también es transferido durante el secante de un BN-gel. Por lo tanto, el gel se incoloro después de la transferencia con éxito, mientras que la membrana va a ejercer un color azul. Además, es importante mencionar que no todos los anticuerpos primarios, que trabaja en la detección después de SDS-PAGE, es aplicable a inmunotransferencia en BN-PAGE. Puede ocurrir que los anticuerpos no reconocen la MPC de interés debido a su epítopo se oculta en la conformación nativa de las proteínas. Para superar este problema, es posible para desnaturalizar las proteínas dentro de la BN-gel antes de la transferencia al hervir el gel en tampón 1x breve muestra de SDS. En nuestro ejemplo, que no tema el BN-gel directamente a la detección de bandas de proteínas. En su lugar, divide a la BN-PAGE de lisado separados por un segundo dimensien SDS-PAGE. En la segunda dimensión SDS-gel, proteínas monoméricas migrar dentro de una diagonal hiperbólico, debido a que el gel de gradiente en el primero y el gel lineal en la segunda dimensión (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Esto permite la fácil identificación de los países socios mediterráneos, ya que se localizan por debajo de esta hiperbólica diagonal. Subcomponentes de una distinta MPC se separan en una línea vertical en la segunda dimensión SDS-PAGE. Componentes que son constituyentes de los PSM dinstinct varios se pueden identificar en una línea horizontal en función del tamaño de la MPC. Sin embargo, hay que tener en cuenta que varios puntos de proteínas que aparecen en una línea vertical también podría formar parte de los complejos que migran por separado en la misma posición en BN-PAGE. La prueba final de que se encuentran en la misma MPC se puede obtener mediante un ensayo en gel a base de anticuerpos turno. En este ensayo, lisado celular se incuba con un anticuerpo contra una proteína representada por uno de los puntos identificados antes de la BN-PAGE. Esto se traduce en un cambio de todos los países socios mediterráneos que contienen esta proteína hacia una mayor masa molecular en la primera dimensión. Otras proteínas que son también una parte de estos países socios mediterráneos se someterán a este cambio de complejos específicos y por lo tanto fácil de identificar en la segunda dimensión SDS-gel. No sólo la composición de los países socios mediterráneos pueden ser analizados por BN-PAGE, sino también la determinación de su estequiometría es posible (y Schamel Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet y otros, 2007.). Para ello, un ensayo de NAMOS (nativo basado en anticuerpos movilidad cambio de ensayo) se puede realizar. Al igual que en el ensayo de gel a base de anticuerpos cambio, los lisados ​​celulares se incuban con anticuerpos monoclonales subunidad anticuerpos específicos. Esto conduce a la inducción de immunoshifts electroforética en los geles BN-, que permiten la inferencia de la medida del cambio en la estequiometría de los países socios mediterráneos En conlusion, BN-PAGE es adecuado para la identificación de los países socios mediterráneos y la determinación de su tamaño, composición, así como la abundancia relativa. Realizado como un ensayo NAMOS, sino que también ofrece la posibilidad de determinar la estequiometría de una cierta MPC. Teniendo en cuenta su aplicabilidad general, esta técnica es una herramienta muy útil para la caracterización de los países socios mediterráneos (Dekker, Müller y otros, 1996.) (Wittig y Schagger 2008); (Wagner, Rehling y otros, 2009.) (Wittig y Schagger 2009) .

blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates

Complejos multiproteicos (PSM) juegan un papel crucial en la señalización celular, ya que la mayoría de las proteínas se pueden encontrar en complejos funcionales o de reglamentación con otras proteínas (Sali, Glaeser et al. 2003). Así, el estudio de las redes de interacción proteína-proteína requiere de la caracterización detallada de los países socios mediterráneos para obtener una comprensión integradora de la función de la proteína y la regulación. Para la identificación y el análisis, los países socios mediterráneos deben ser separados en condiciones nativas. En este video, se describe el análisis de los países socios mediterráneos por el azul de electroforesis en gel de poliacrilamida nativo (BN-PAGE). BN-PAGE es una técnica que permite la separación de los PSM en una conformación nativa con una resolución mayor que la ofrecida por filtración en gel o ultracentrifugación de densidad de sacarosa, y por tanto es útil para determinar el tamaño del MPC, la composición y abundancia relativa (Schagger y von Jagow 1991) ; (Schagger, Cramer et al, 1994).. Mediante este método, las proteínas se separan según su tamaño y forma hidrodinámica en una matriz de poliacrilamida. En este caso, se demuestra el análisis de los PSM del total de lisados ​​celulares, señalando que la diálisis lisado es el paso crucial para hacer BN-PAGE aplicable a las muestras biológicas. Usando una combinación de primera dimensión BN-y segunda dimensión SDS-PAGE, se muestra que los países socios mediterráneos separados por BN-PAGE se pueden subdividir en sus componentes individuales por SDS-PAGE. La visualización de los componentes MPC después de la separación de gel se realiza por immunoblotting estándar. A modo de ejemplo para el análisis de MPC por BN-PAGE, se optó por el 19S bien caracterizados eucariotas, 20S, 26S y los proteasomas.

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Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

En este video, se describe la caracterización de los complejos multiproteicos (PSM) por el azul electroforesis nativa en gel de poliacrilamida (BN-PAGE). En una primera dimensión, se dializan lisados ​​celulares están separados por BN-PAGE para identificar PSM individual. En una segunda dimensión SDS-PAGE, PSM de interés se subdividen para analizar sus componentes por inmunotransferencia.

Azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (BN-PAGE) para el análisis de los complejos Multiproteinas de lisados ​​celulares

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

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Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Gradiente desnaturalizante electroforesis en gel (DGGE)

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