Name: blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates at JoVE.com

Vi tackar Michael Reth, Hermann Schägger och Margarita Camacho-Carvajal för vetenskapligt stöd. Detta arbete har finansierats av FORSYS från Bundesministerium für Bildung och Forschung (BMBF), genom BIOS från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), och stöds delvis av Excellence initiativ av den tyska federala och delstatliga regeringar (GSC-4, Spemann Graduate School ).

<ol>
	<li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer:+identification+of+three+dimer-specific+subunits.">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li><li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+Blue+native/SDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates:+a+proteomics+approach.">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li><li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells.">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li><li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+words+to+literature+in+structural+proteomics.">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li><li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li><li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response.">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li><li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor.">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li><li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+(NAMOS-assay)+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes.">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li><li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis.">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li></ol>

I denna studie beskriver vi en analys av Medelhavsländerna av BN-PAGE. En 2D-metod används för första separata partnerländerna i modersmål förhållanden, och sedan för att ytterligare dela upp dem i sina beståndsdelar genom en andra dimensionen SDS-PAGE. Provföremålen från cell lysates. För lösningsgörande många Medelhavsländerna, är ett lämpligt rengöringsmedel behövs, vilket bevarar proteinets struktur komplex. Här använder vi 0,1% Triton X-100. Men den optimala rengöringsmedel och dess lämplig koncentration måste bestämmas empiriskt för varje MPC. I händelse av Triton X-100, till exempel, har det rapporterats att låga tvättmedel koncentrationer möjligt att identifiera en dimeriskt form av F 1 F 0-ATPas komplex (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Högre Triton X-100 halterna dock leda till en dissociation av dimer och till en motsvarande ökning av monomera F 1 F 0-ATPas komplex. Detta är i linje med en av våra tidigare studier, vi visar att multivalenta T-cells receptor komplex (TCR) bevaras när extraheras med låga koncentrationer av Brij 96, medan användningen av högre koncentration eller en annan rengöringsmedel som heter digitonin resultat utvinning av monomera TCR (Schamel, Arechaga et al. 2005). Vanligt använda tvättmedel som kan testas inkludera digitonin (0,5 till 1%), Triton X-100 (0,1 till 0,5%), Brij 96 (0,1 till 0,5%), eller dodecylmaltoside (0,1 till 0,5%). Dessa reagenser är nonjoniska tvättmedel, som tenderar att vara bäst för MPC stabilitet. Var medveten om att kontakten med SDS och andra starka rengöringsmedel bör undvikas (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Dialys av lysates krävs för att uppnå MPC separation i ett BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004.), (Heiss, Junkes et al 2005.). Det verkar som om justering av salthalt eller borttagande av lågmolekylära orenheter är avgörande för hög upplösning. Det är anmärkningsvärt att också membran förberedelser och Medelhavsländerna, som har immunopurified och senare elueras från antikroppar, är lämpliga för BN-PAGE (Swamy, Siegers et al. 2006). I båda fallen har proverna inte dialyseras för BN-PAGE separation, om membranet lys eller upplösning sker i BN-lyseringsbuffert. För protein separation genom BN-sida, färgen Coomassie blå behövs, som binder ospecifikt till proteiner och täcker dem med negativa laddningar. Därmed gör Coomassie blå genom elektrofores rörlighet av proteiner mot katoden vid neutralt pH (Schägger och von Jagow 1991), (Schägger, Cramer et al 1994.). Vidare förhindrar Coomassie blå proteinaggregering i staplingsordningen gelen under elektrofores. För BN-PAGE, har Coomassie G250 användas i stället för Coomassie blå R250 och kolloidalt Coomassie blues. Innan du kör en BN-gel är det nödvändigt att säkerställa att den andel av gelen passar till den förväntade storleken på MPC av intresse. Prefabricerade BN-geler med olika lutningar och lämpliga buffertar finns kommersiellt tillgängliga från Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Men BN-geler kan också vara beredd med en lutning mixer tillsammans med en persistaltic pump. För att garantera en intakt lutning bör vätskeflödet ständigt under hälla och bubblor bör undvikas. Vi rekommenderar lastning av olika provspädningar på gelen, eftersom överbelastning kan leda till protein nederbörd under elektrofores processen. Dessutom bör BN-geler köras vid 4 ° C för att förhindra proteinnedbrytning och att hålla Medelhavsländerna intakt. Efter BN-PAGE, visualisering av Medelhavsländerna kan uppnås genom Coomassie lysande blå färgning, silver färgning eller immunoblotting. Protein band visualiseras genom Coomassie eller silver färgning är lämpliga för vidare analys med masspektrometri (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Vid immunoblotting den optimala överföringen förutsättningarna för partnerländerna i Medelhavsområdet intresse måste bestämmas empiriskt. Var medveten om att Coomassie blå också överförs under blotting av ett BN-gel. Därför kommer gelen vara färglös efter framgångsrik överföring, medan membranet kommer att ha en blå färg. Vidare är det viktigt att nämna att inte alla primära antikroppen, som arbetar för detektion efter SDS-PAGE, är tillämplig på immunoblotting på BN-PAGE. Det kan hända att antikroppar inte känner igen MPC av intresse eftersom deras epitop är gömd i den ursprungliga konformation av proteiner. För att lösa detta problem, är det möjligt att denaturera proteiner inom BN-gel innan överföringen genom att koka gelen inom kort i 1x SDS prov buffert. I vårt exempel har vi Utsätt inte BN-gel direkt till upptäckt av protein band. Istället delade vi ytterligare BN-page-separerade lysat av en andra dimensipå SDS-PAGE. I den andra dimensionen SDS-gel, monomera proteiner vandrar i en hyperbolisk diagonal på grund av lutningen gel i den första och den linjära gel i den andra dimensionen (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Detta gör att enkel identifiering av Medelhavsländerna, eftersom de är lokaliserade under denna hyperboliska diagonalen. Delkomponenter av en distinkt MPC separeras i en vertikal linje i den andra dimensionen SDS-PAGE. Komponenter som är beståndsdelar i flera dinstinct Medelhavsländerna kan identifieras på en horisontell linje beroende på storleken på MPC. Det har dock beaktas att flera protein fläckar visas i en vertikal linje även kan vara en del av separata komplex som vandrar på samma position i BN-PAGE. Det slutliga beviset på att de finns i samma MPC kan erhållas genom att en antikropp-baserad gel shift assay. I denna analys är cellulära lysat inkuberas med en antikropp mot ett protein som representeras av en av de identifierade platserna före BN-PAGE. Detta resulterar i en förskjutning av alla Medelhavsländerna som innehåller detta protein mot en högre molekylvikt i den första dimensionen. Andra proteiner som också är en del av dessa Medelhavsländerna kommer att genomgå denna komplexa specifika skift och är därför lätt att identifiera i den andra dimensionen SDS-gel. Inte bara sammansättningen av Medelhavsländerna kan analyseras med BN-sida, men även fastställandet av deras stökiometri är möjlig (Schamel och Reth 2000), (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al 2007.). För detta ändamål kan en Namos analys (native antikroppsbaserade rörlighet-Shift test) utföras. Liksom i antikropps-baserade gel shift assay, är det cellulära lysates inkuberas med monoklonala subenheten-specifika antikroppar. Detta leder till induktion av elektroforetiska immunoshifts i BN-gel, som gör att slutsatsen av omfattningen av skiftet på stökiometri för Medelhavsländerna I conlusion är BN-PAGE lämpar sig för identifiering av Medelhavsländerna och bestämning av deras storlek, sammansättning, samt relativa överflöd. Utföras som en Namos analys, erbjuder den också möjlighet att bestämma stökiometri av en viss MPC. Med tanke på dess allmänt bindande, är denna teknik ett mycket användbart verktyg för karakterisering av Medelhavsländerna (Dekker, Müller et al 1996.), (Wittig och Schagger 2008), (Wagner, Rehling et al 2009.), (Wittig och Schägger 2009) .

blue native polyacrylamide gel electrophoresis (bn-page) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates

Multiproteinkomplex (Medelhavsländerna) spelar en viktig roll i cellsignalering, eftersom de flesta proteiner finns i funktionella eller reglerande komplex med andra proteiner (Sali, Glaeser et al. 2003). Därför kräver studier av protein-protein växelverkan nätverken en detaljerad karakterisering av Medelhavsländerna att få en integrerad förståelse av proteiners funktion och reglering. För identifiering och analys måste Medelhavsländerna separeras i enlighet med infödda förhållanden. I denna video beskriver vi en analys av Medelhavsländerna med blå infödda polyakrylamidgelelektrofores (BN-sida). BN-PAGE är en teknik som möjliggör separation av Medelhavsländerna i en infödd konformation med en högre upplösning än erbjuds av gelfiltrering eller sackaros densitet ultracentrifugering, och är därför lämpligt att bestämma MPC storlek, sammansättning och relativa förekomst (Schägger och von Jagow 1991) , (Schägger, Cramer et al 1994.). Genom denna metod är proteiner separeras efter sina hydrodynamiska storlek och form i ett polyakrylamid matris. Här visar vi analys av Medelhavsländerna av totala cellulära lysates och påpekade att lysat dialys är den avgörande steg för att göra BN-PAGE är tillämpliga på dessa biologiska prover. Med en kombination av första dimensionen BN-och andra dimensionen SDS-PAGE, visar vi att Medelhavsländerna åtskilda av BN-PAGE ytterligare kan delas upp i sina enskilda beståndsdelar med SDS-PAGE. Visualisering av MPC komponenterna på gel separation utförs av standard immunoblotting. Som ett exempel på MPC analys av BN-PAGE, valde vi väldefinierad eukaryota 19S, 20S och 26S proteasomer.

Watch this Scientific Journal Video about Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates at JoVE.com

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

I denna video beskriver vi karakterisering av Multiproteinkomplex (Medelhavsländerna) med blå infödda polyakrylamidgelelektrofores (BN-sida). I en första dimension är dialyseras cellulära lysates åtskilda av BN-PAGE att identifiera enskilda partnerländerna. I en andra dimension SDS-PAGE är Medelhavsländerna av intresse indelade för att analysera sina väljare genom att immunoblotting.

Blå Native polyakrylamidgelelektrofores (BN-PAGE) för analys av Multiproteinkomplex från Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Denaturering Gradient gelelektrofores (DGGE)

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Screening för Amyloid aggregation av Semi-Denaturering Tvättmedel-agarosgelelektrofores

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Kartläggning av protein komplex med kvantitativa proteomik i S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturering Urea polyakrylamidgelelektrofores (urea SIDA)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Hälla och köra ett protein Gel genom att återanvända Commercial Kassetter

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarosgelelektroföres för separation av DNA-fragment

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

En ny metod för jämförande analys av multiproteinkomplex baserat på<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolic Märkning och kvantitativ masspektrometri

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

AFM-baserad Kartläggning av de elastiska egenskaperna hos cellväggar: i Tissue, Cellulär och Subcellulära resolutioner

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucin agarosgelelektrofores: Western blotting för hög molekylvikt Glykoproteiner


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...