Name: preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction
Uploaded: 2010-12-14T17:00:00
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我々は、細胞牽引力の定量化（Sabass ら 、2008）で使用されている計算ソフトウェアを追跡するためのウルリッヒシュワルツの研究室に感謝。この作業は、SPの冬にMLガルデルとメディカルサイエンティストナショナルリサーチサービス賞（5 T32 GM07281）にバローズウェルカムのキャリア賞とNIH Directorのパイオニア賞（DP10D00354）によってサポートされていました。

1。カバーの表面のアクティブ化<ol><li>カバースリップ（＃1.5、22x40 mm）が埃を掃除したり削除したり、前述のプロトコル（ウォーターマン-ストアラー、1998）で石鹸とエタノール洗浄のシリーズを使って掃除している。 </li><li>ステンレス製のホルダーのラックに配置しカバーガラスは、そのようなそのカバーグラスを離間し、触れていない。 </li><li>化学ヒュームフード（ニトリル手袋とゴ?...

<ol>
	<li>Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamid+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays.">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li><li>Engler, A., Bacakova, L. N. e. w. m. a. n., Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. i. s. c. h. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+compliance+versus+ligand+in+cell+on+gel+responses.">Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses.</a> Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).</li><li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed.">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).</li><li>Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+the+spread+area,+contractility,+and+migration+of+balb/c+3T3+fibroblasts+adhered+to+fibronectin-+and+RGD-modified+substrata.">Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata.</a> Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).</li><li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+mechanics+of+endothelial+cell+spreading.">The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading.</a> Biophys J. 89, 676-689 (2005).</li><li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions.">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophys J. 94, 207-220 (2008).</li><li>Yeung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology,+cytoskeletal+structure,+and+adhesion.">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li><li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule/organelle+motility+assays.">Microtubule/organelle motility assays.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).</li></ol>

手順は、計算追跡ルーチン（Sabass ら 、2008）の実装と共に、トラクション力顕微鏡（TFM）の実験のセットアップのためにここで説明する、ミクロンスケールの空間分解能での細胞の力の定量化が可能になります。実験的なプロトコルを最適化するために、それはECMの配位子の均一なコーティングで、純粋で均一なゲル基材を形成することが重要です。我々は、以下の潜在的な落とし穴?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>28, 177-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40% Acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>161-0140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2% Bis-acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher BioReagents</td>
<td>BP1404</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEMED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher BioReagents</td>
<td>BP 150-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium persulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP179</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40nm fluorescent micro-spheres</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F8789</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulfo-SANPAH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>22589</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal imaging chamber (RC-30)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>64-0320</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslip spinner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Home-built</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultraviolet lamp CL1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>UVP</td>
<td>95-0228-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless steel rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72239-04</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen
</td>
<td>A-20770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrazine hydrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>225819</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium meta-periodate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>20504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopropanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A416-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354236</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (#1.5)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940&#x2010;224</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>16120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SOPUS Products</td>
<td>www.rainx.com</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetic Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>64-19-7</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction

細胞外マトリックス（ECM）に対する細胞接着の調節は、細胞遊走およびECMリモデリングに不可欠です。接着斑は、そのECMに結合収縮F -アクチンの細胞骨格の高分子アセンブリです。この接続は、基礎となる基板に細胞膜を通過する細胞内の機械的な力の伝達が可能になります。最近の研究は、ECMの機械的性質は、接着斑とF -アクチンの形態だけでなく、細胞の分化、分裂、増殖と移動を含む多くの生理学的プロセスを調節示している。従って、細胞培養基板の使用は、正確に制御し、ECMの機械的特性を調節することがますます普及している方法となっている。 接着細胞の接着斑での牽引力を定量化するために、準拠した基板は、高分解能イメージングと法と呼ばれるトラクション力顕微鏡（TFM）の計算手法と組み合わせて使用​​されています。この手法は、細胞の収縮によって誘発される基板の変形の局所大きさと方向の測定値に依存しています。蛍光標識タンパク質の高分解能蛍光顕微鏡と組み合わせることで、それは牽引力と細胞骨格の組織とリモデリングを相関させることが可能です。 ここでは、細胞収縮を測定するのに適している十分に特徴付け、調整可能な機械的剛性、ある細胞培養基板を作成する目的のための二次元、準拠したマトリックスの調製のための詳細な実験プロトコルを提示する。これらのプロトコルは、ポリアクリルアミドハイドロゲルの製造、そのようなゲル上にECMタンパク質のコーティング、ゲル上のめっきセル、および灌流チャンバーを用いた高分解能共焦点顕微鏡などがあります。さらに、我々は引用TFMプロトコルを使用して、細胞の力の位置と大きさを示すデータの代表的なサンプルを提供しています。

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

このビデオでは、我々は細胞培養に適した準拠、細胞外マトリックス（ECM）コーティングされた基材を作製するために使用される実験技術を実証し、牽引力顕微鏡に適していると、細胞の挙動にECMの剛性の影響を観察している。

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The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

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