Name: preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction
Uploaded: 2010-12-14T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction at JoVE.com

Vi tackar labbet av Ulrich Schwarz för numerisk mjukvara som används i kvantifiering av cellulära dragkrafter (Sabass et al., 2008). Detta arbete stöddes av en Burroughs Wellcome Karriär Award och NIH direktörens Pioneer Award (DP10D00354) till ML Gardel och medicinsk forskare National Research Service Award (5 T32 GM07281) till SP Winter.

1. Aktivera täckglas ytan <ol><li> Täckglas (# 1.5, 22x40 mm) rengöras med en serie av tvål och etanol tvättar i en tidigare beskrivits protokoll (Waterman-Storer, 1998) att rengöra och ta bort damm. </li><li> Placera täckglas i en rostfri hållare rack, är sådana att täckglas avstånd från varandra och inte röra. </li><li> I kemiska dragskåp (nitril och rekommenderas skyddsglasögon), späd full styrka 3-aminopropyltrimethoxysilane i isopropanol för en slutlig koncentration av 2% (2 ml silan / 100 ml is...

<ol>
	<li>Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamid+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays.">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li><li>Engler, A., Bacakova, L. N. e. w. m. a. n., Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. i. s. c. h. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+compliance+versus+ligand+in+cell+on+gel+responses.">Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses.</a> Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).</li><li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed.">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).</li><li>Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+the+spread+area,+contractility,+and+migration+of+balb/c+3T3+fibroblasts+adhered+to+fibronectin-+and+RGD-modified+substrata.">Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata.</a> Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).</li><li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+mechanics+of+endothelial+cell+spreading.">The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading.</a> Biophys J. 89, 676-689 (2005).</li><li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions.">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophys J. 94, 207-220 (2008).</li><li>Yeung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology,+cytoskeletal+structure,+and+adhesion.">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li><li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule/organelle+motility+assays.">Microtubule/organelle motility assays.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).</li></ol>

Det förfarande som beskrivs här för konfigurering av en dragkraft mikroskopi (TFM) experiment, tillsammans med genomförandet av datoriserad spårning rutiner (Sabass et al., 2008), möjliggör kvantifiering av cellulära krafter med micron skala rumslig upplösning. För att optimera experimentella protokoll, är det viktigt att bilda en ren och enhetlig gel substrat med jämn beläggning av ECM-ligand. Vi diskuterar potentiella fallgropar nedan: Icke-enhetlig Gel Surface eller tå...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>28, 177-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40% Acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>161-0140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2% Bis-acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher BioReagents</td>
<td>BP1404</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEMED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher BioReagents</td>
<td>BP 150-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium persulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP179</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40nm fluorescent micro-spheres</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F8789</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulfo-SANPAH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>22589</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal imaging chamber (RC-30)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>64-0320</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslip spinner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Home-built</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultraviolet lamp CL1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>UVP</td>
<td>95-0228-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless steel rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72239-04</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen
</td>
<td>A-20770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrazine hydrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>225819</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium meta-periodate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>20504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopropanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A416-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354236</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (#1.5)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940&#x2010;224</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>16120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SOPUS Products</td>
<td>www.rainx.com</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetic Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>64-19-7</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction

Regleringen av cellulära vidhäftning till den extracellulära matrix (ECM) är avgörande för cell migration och ECM ombyggnad. Fokal sammanväxningar är makromolekylära församlingar att koppla kontraktila F-aktin cytoskelettet till ECM. Denna anslutning möjliggör överföring av intracellulära mekaniska krafter genom cellmembranet till underliggande substrat. Senaste arbete har visat att mekaniska egenskaper ECM reglerar fokus vidhäftning och F-aktin morfologi samt ett stort antal fysiologiska processer, inklusive celldifferentiering, division, spridning och migration. Således har användningen av substrat cellodling blivit en allt vanligare metod för att exakt kontrollera och modulera ECM mekaniska egenskaper. För att kvantifiera dragkrafter i fokus sammanväxningar i en anhängare cell är kompatibla substrat används tillsammans med hög upplösning bildbehandling och beräkningsteknik i en sk metod dragkraft mikroskopi (TFM). Denna teknik bygger på mätningar av det lokala storlek och riktning av substrat deformationer orsakade av cellulära kontraktion. I kombination med hög upplösning fluorescensmikroskopi av fluorescerande taggade proteiner, är det möjligt att korrelera cytoskelettala organisation och ombyggnad med dragkrafter. Här presenterar vi ett detaljerat försöksprotokoll för beredning av två-dimensionell, kompatibel matriser i syfte att skapa ett substrat cellkultur med en väldefinierad, avstämbara mekanisk styvhet, som är lämplig för att mäta cellulär kontraktion. Dessa protokoll omfattar tillverkning av polyakrylamid hydrogeler, ytbeläggning ECM proteiner på sådana geler, plätering celler geler, och högupplösta konfokalmikroskopi med en perfusion kammare. Dessutom ger vi ett representativt urval av data som visar lokalisering och omfattning av cellulära krafter med hjälp av ovan TFM protokoll.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction at JoVE.com

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

I denna video visar vi de experimentella tekniker som används för att tillverka kompatibla, extracellulära matrix (ECM) substrat som lämpar sig för cellodling och som kan bli föremål för dragkraft mikroskopi och observera effekter av ECM stelhet på cellens beteende.

Beredning av Klagomål Matriser för kvantifiering Cellular Sammandragning

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Modeller och metoder för att utvärdera Transport av Drug Delivery System Across Cellular Hinder

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Upprättande och Photoacoustic Analys av Cellular fordon som innehåller guld nanostavar

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

Neonatal Cardiac Ställningar: Nya Matriser för regenerativ studier

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

2D och 3D matriser för att studera linjär invadosombildning och aktivitet

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Automatiserad Contraction analys av Human Engineered hjärtvävnad för Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

Däggdjur celldelning i 3D matriser via kvantitativa Confocal speglar mikroskopi

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

Gel-seq: En metod för samtidig sekvensering bibliotek beredning av DNA och RNA med hjälp av Hydrogel matriser

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Tillverkning av en multiplexade konstgjorda cellulära mikromiljö Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Ompressning gentranskription genom att omdirigera cellulära maskineriet med kemiska epigenetiska modifierare

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

Romanen processen för 3D utskrift cell-lösa matriser

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...