Name: upright imaging of drosophila embryos
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Upright Imaging of Drosophila Embryos at JoVE.com

De auteurs zijn vooral schatplichtig aan Deborah Harris en Danielle MacKay. Steun voor dit werk werd geleverd door het departement Biologie en de Hogeschool voor de Kunsten en Wetenschappen van CWRU, en door HHMI verlenen nummer 52005866 voor de ondersteuning van undergraduate onderwijs in de biologische wetenschappen.

1. Imaging Methodologie <ol><li> Gelei Smelt glycerine in een 55 ° C graden waterbad gedurende 20-30 minuten tot het een homogene vloeistof. Swirl, doe maar niet schudden de fles om de vorming van luchtbellen te voorkomen. </li><li> Terwijl de gelei smelt, breng een dunne laag van glycerol met behulp van een Kimwipe op een schoon glasplaatje (optioneel). </li><li> Pipetteer 1 tot 1,5 ml gesmolten glycerine gelei met behulp van een cut P1000 pipettip op het oppervlak van de dia om een ​​dunne eerste laag te creëren. Pipet voorzichtig om luchtbellen te vermijden. </li><li> Laat de gelei stollen gedurende 5 minuten op een horizontaal oppervlak, dan is de schuif plaats bij -20 ° C gedurende 5 minuten en ga verder met embryo uitlijning. U kunt ook betrekking hebben op de dia met Saran Wrap en plaats deze bij 4 ° C gedurende maximaal 5 dagen. </li><li> Pipetteer een kleine druppel gekleurd embryo&#39;s in 70% glycerol / PBS of andere antifade glycerol-based montage media (bijvoorbeeld Slowfade of Vectashield) aan de zijde van de gelei beddengoed. </li><li> Begin pre-embryo&#39;s door het afstemmen van de individueel over te dragen van de drop naar de gelei oppervlak. Overbrengen met behulp van een schuine injectienaald, het gebruik van de schuine zijde als een lepel. </li><li> Ruwweg plaats van de embryo&#39;s langs de 2 tot 3 kolommen. Als een embryo vast komt te zitten in de naald, roer het in de druppel die de andere embryo&#39;s om deze los. Verspil geen tijd zorgvuldig uitlijnen hen op dit punt. Laat wat ruimte tussen de kolommen. </li><li> Lijn de embryo&#39;s door ze horizontaal op de gelei medium met behulp van de injectienaald. Tijdens het glijden, oriënteren de koppen en staarten in dezelfde richting. Maak ze parallel aan elkaar langs de kolom. Verwijder overtollig van PBS glycerol links als een parcours met een stukje gedraaid Kimiwipe. Let op: Excess glycerol zal leiden tot embryo&#39;s te losjes verpakt binnen gel, wat resulteert in scheiding van de twee gelei lagen, waardoor het moeilijk om te knippen en te monteren. Omgekeerd zal het verwijderen van te veel glycerol droog en plat embryo&#39;s. </li><li> Gebruik een afgezaagd geel tip om een ​​dun laagje gelei verspreid over de embryo&#39;s (50-150 pi, afhankelijk van hoeveel waren uitgelijnd). </li><li> Plaats dia in -20 ° C vriezer voor 10-20 min. of bewaar deze bij 4 ° C gedurende de nacht. Zorg ervoor dat de gelei is helemaal stijf voor het snijden. Anders zal het blok van de embryo&#39;s zeer moeilijk te accijnzen. De beste resultaten voor het snijden worden verkregen op de volgende dag. </li><li> Onder een ontleding bereik, gebruik dan een scheermesje om volledig dwars door de gelei op beide zijden van de lijn embryo&#39;s. Houd het scheermesje in een hoek van 90 ° rechte zaagsneden te maken. De bezuinigingen moeten worden gemaakt zeer dicht bij de voorste en achterste polen van de embryo&#39;s om overtollige gelei die kunnen belemmeren beeldvorming te voorkomen. </li><li> Voeg 100 tot 200 ul van koude PBT (4 ° C, PBS +0,1% Tween 20) naast de bezuinigingen en voorzichtig afschrapen van de gelei tussen embryo&#39;s met behulp van een spatel. Opmerking: Het wasmiddel in PBT helpt bij het verwijderen van de gelei van de dia zonder beschadiging van de embryo&#39;s. </li><li> Met behulp van een naald, de overdracht het blok van de gelei met embedded embryo&#39;s op een schoon objectglas voor verdere snijden. Gesneden kleinere blokken met 5-7 embryo&#39;s. Gebruik PBT om gemakkelijk te verplaatsen rond de gelei blok. Als alternatief, plaats het blok op een droge ondergrond te laten hechten aan het glas, waardoor meer stabiliteit voor het precies trimmen van de gelei, indien nodig, creëert. </li><li> Flip rechtop de embryo&#39;s ingebed in de gelei met behulp van een scheermesje en een naald. Voor visualisatie onder de microscoop, ga dan verder met een van de twee onderstaande stappen, afhankelijk van het type microscoop stand wordt gebruikt. </li><li> Omkeermicroscoop: plaats embryo blokken afgewerkt op een lange dekglaasje, met embryo&#39;s in een rechtopstaande positie. Zorg ervoor dat de zijde van het embryo met de minste hoeveelheid gelei zal in nauwer contact met de doelstelling. </li><li> Rechtop microscoop: maak twee stapels met vier # 1 coverslips gelijmd met superlijm om gebruikt te worden als &quot;ondersteunt&quot;, en het embryo blok in glycerol plaats in tussen de &quot;ondersteunt&quot;. Brug de stapels met behulp van een lange dekglaasje aan. </li><li> Voor de confocale analyse, controleer dan de werkafstand van de doelstellingen die moeten worden gebruikt om te achterhalen of u foto helemaal door het embryo of slechts gedeeltelijk. Bijvoorbeeld, D. melanogaster embryo&#39;s ~ 0,55 mm in lengte en kan volledig worden afgebeeld met behulp van een Zeiss 20x Plan-Apo of een 40x LD Neo-Fluor doelstelling. De volgende website is informatie over de beschikbare Zeiss doelstellingen en geeft u de mogelijkheid om doelstellingen te zoeken op werkafstanden: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Representatieve resultaten Omdat het embryo intact worden gelaten, kan deze methode worden gebruikt om nauwkeurige metingen van embryo grootte en afstanden tussen de genexpressie patronen te nemen. In figuur 1 geven we een blastoderm stadium embryo&#39;s gekleurd met de nucleaire vlek DAPI (blauw), anti-Dorsale eiwit (rood), SOG mRNA (geel) en SNA mRNA (groen). Morfologische processes, kan zoals invaginatie van het mesoderm (Figuur 2A, B) en migratie van mesodermale cellen (Figuur 3 en 4) ook worden gevisualiseerd met behulp van deze methode. Verschillende Z-posities langs de DV-as kan worden verkregen door het veranderen van de focal plane, zoals weergegeven in de figuren 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Rechtop optische schijfje van een intacte embryo in blastoderm stadium. Dubbelklik kleuring voor mRNA en eiwit. Doelwit mRNA&#39;s voor in-situ sondes (SOG en SNA) en eiwit gekleurd door primaire antilichaam (anti-Dorsale) zijn aangegeven in de figuur. DAPI werd gebruikt om de kernen label. Merk op dat de uitdrukking van SOG en SNA apicaal bevinden zich in het cytoplasma, terwijl de uitdrukking van Dorsale is kernenergie. Sterke signalen van SOG ontluikende transcripten die zich bevinden in de kernen is ook te zien op deze vergroting. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Rechtop beeldvorming van een intacte gastrulating embryo. MRNA probes gebruikt en de bijbehorende kleuren zijn aangegeven in de figuur. A) Merk op dat in dit stadium, drie genen gekleurd met dezelfde Fluor (SNA, SOG en DPP, in het groen), worden uitgedrukt in ruimtelijk gescheiden domeinen. De invaginating mesoderm drukt SNA, de neuroblast laag drukt IND en het ectoderm uitdrukt DPP, terwijl de SOG uitdrukking is nog steeds aanwezig in ventrale regio&#39;s van het zenuwstelsel. B) In een diepere confocale vliegtuig van hetzelfde embryo, merken we de basis van het invaginating mesoderm sterk tot uitdrukking SNA, maar de apicale regio uitdrukt lagere niveaus. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Rechtop beeldvorming van een intacte embryo met een kiem band uitgebreid SOG RNA (geel);. Slak, IND en DPP mRNAs (groen), Dorsale eiwit (rood). Kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). A) Focal plane in de buurt van embryo hoofd. B) Een ander focal plane in de kofferbak regio van hetzelfde embryo. Let op de massa van mesodermale cellen voordat laterale migratie (te vergelijken met 4 figuur) liggen dicht bij de ventrale middellijn aan beide zijden van een kiem-band uitgebreid embryo. Delamineren neuroblasts zijn geëtiketteerd in groen (IND en SNA). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Rechtop beeldvorming van een intacte embryo tijdens de kiem band extensie SOG RNA (geel);. Slak, IND en DPP mRNAs (groen), Dorsale eiwit (rood). A) Let op de delamineren neuroblasts van het epitheel (pijl), gebeitst zowel voor de IND en SNA in dit stadium (groen). Let ook op de beperkte uitdrukking van SOG aan de ventrale middellijn (geel). Expressie van DPP in dit stadium te zien op zijkanten van het embryo (asterisk). B) Optische gedeelte in dezelfde embryo getoond in A aan het einde van het embryo lengte, die overeenkomt met mid-posterior regio. Het ventrale middellijn cellen zijn gekleurd voor SOG.

<ol>
	<li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos.">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li><li>Gr&#946;hans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila.">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li><li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol.">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li><li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila.">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li></ol>

Het nemen van doorsnede beelden van Drosophila embryo&#39;s kan lastig zijn, omdat het vereist hetzij een zorgvuldige hand dissectie van de plakjes 2 of het gebruik van embedded media voor de verwerking van microtoom, die meestal nadelig is voor tl-kleuringen. Als alternatief kan Z-stacks in een confocale microscoop worden gebruikt om de 3D-reconstructie van de doorsnede beelden te maken. Het is echter tijdrovend om meerdere dunne plakjes Confocale zorgen voor een nauwkeurige 3D-reconstructie en fotobleking wordt problematisch. Een andere zorg bij de beeldvorming embryo&#39;s die in lengterichting zijn gemonteerd is de lichtverstrooiing die optreedt bij het ​​bereiken van diepere delen van het embryo, die ook bemoeilijkt het nemen van nauwkeurige metingen van fluorescerende signalen ten behoeve van kwantificering van eiwit of mRNA expressie niveaus 1. Zelfs met een twee-foton confocale microscoop, lichtverstrooiing is nog een probleem vanwege de ondoorzichtigheid van de dooier materiaal in het midden van het embryo, welke selectie van montage media voor optimale transparantie van het monster te beperkt maakt. Om deze problemen te omzeilen, een nieuwe techniek genaamd &quot;End-on&quot; beeldvorming van de positionering embryo&#39;s verticaal werd onlangs ontwikkeld om beeld zowel live als vaste monsters 4. In deze paper hebben we een nieuw protocol voor verticaal geplaatste embryo&#39;s dat een eenvoudige voorbereiding en visualisatie van de vaste embryo&#39;s of weefsels van elke grootte en vorm die met meerdere gebeitst in situ sondes 3 mogelijk maakt. Onze methode bestaat uit het gebruik van een montage media met een geleiachtige consistentie die wordt gebruikt om embryo&#39;s zet je lijn binnen het. Snijd blokjes van deze montage media met embedded embryo&#39;s kan rechtop worden geplaatst voordat beeldvorming in elk type van confocale microscoop. Door het inbedden van de embryo&#39;s in de gelei en plaats ze verticaal, we zijn in staat om horizontale doorsnede te nemen met behulp van confocale microscopie, waarbij cellen langs de dorsale-ventrale as van het embryo gelijktijdig worden gepresenteerd. Dit is een significante verbetering voor de kwantificering werken, omdat problemen van lichtverstrooiing en fotobleken van fluorescerende kleurstoffen die optreedt bij conventionele Z-stack reconstructie van lengterichting gemonteerde embryo&#39;s zijn nu geëlimineerd. Zo, kwantificering van genexpressie of eiwit niveaus langs de rug-buik as is nauwkeurig, aangezien cellen zich aan tegenover rug-buik posities worden afgebeeld op hetzelfde tijdstip en op dezelfde confocale Z-positie. Daarnaast kan de beschreven methode stelt ons in staat om een complete 2-D beeld te krijgen over de rug-ventrale as van een 3-D-embryo zonder het gebruik van complexe computationele afrollen methoden om cellen op verschillende posities langs de DV-as 6 visualiseren. Een aantal van de kritische stappen omvatten het verwijderen van overtollige glycerol na het uitlijnen van embryo&#39;s, om te voorkomen dat verdeeld tussen de twee lagen van gelei. Echter, als het monster te uitgedroogd, zal het resulterende beeld worden misvormd en verkeerd morfologie. Bovendien, als de gelei medium rond het embryo wordt gesneden in een hoek in plaats van recht, kan het resulterende beeld lijken minder rond en meer ovular in vorm, als gevolg van een verkeerde positionering van de embryo&#39;s op een andere hoek dan 90 graden. Tot slot, als de gelei is niet nauw genoeg is gesneden om de embryo op de voorste / posterior eindigt, is het niet mogelijk om een ​​goed beeld te krijgen, want de doelstelling van de werkafstand zou vooral gebruikt worden om zich te concentreren in de gelei en niet het embryo. Een andere belangrijke stap die nodig kunnen zijn bij het beeld laat gastrulating embryo is om zorgvuldig de stadia van belang soort onder de reikwijdte voor het uitlijnen hen. Meestal worden embryo&#39;s opgevoerd op basis van morfologische kenmerken die kunnen de meeste gemakkelijk te herkennen wanneer in een longitudinale positie. Onder andere wijzigingen die kunnen worden gemaakt met deze methode is om een ​​anti-fade reagens (bv p-fenyleendiamine of PPD) op te nemen in de tweede laag van gelei te helpen beschermen tegen fotobleken van fluorescerende kleurstoffen.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycerin Jelly mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences Company</td>
<td>17998-10</td>
<td>Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss LSM 700 Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-544-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72204-02</td>
<td>Size 1 &frac12; (specific for the objectives used in this work).</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slips (for making supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherfinest</td>
<td>12-544-10</td>
<td>Use four coverslips glued with superglue. </td>
</tr>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td>
<td>M420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Steel back single edge industrial blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>21-401-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hypodermic needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>1482610</td>
<td>26 Gauge</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

upright imaging of drosophila embryos

Verschillende bekende morfogenetische gradiënten en cellulaire bewegingen optreden langs de dorsale / ventrale as van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo. Echter, de huidige technieken die gebruikt worden om dergelijke processen te bekijken zijn enigszins beperkt. Het volgende protocol beschrijft een nieuwe techniek voor het monteren van vaste en gelabeld<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s voor coronale bekijken met confocale beeldvorming. Deze methode bestaat uit inbedding van embryo&#39;s tussen de twee lagen van glycerine gelei montage media en beeldvorming gelei strips rechtop geplaatst. De eerste stap voor daartussen de embryo&#39;s is om een ​​dunne bedding van glycerine gelei op een dia. Vervolgens worden embryo&#39;s zorgvuldig afgestemd op dit oppervlak en bedekt met een tweede laag van gelei. Na de tweede laag is gestold, zijn reepjes gesneden gelei en bladerde rechtop voor de beeldvorming. Alternatieven zijn beschreven voor het visualiseren van de embryo&#39;s, afhankelijk van het type microscoop staan ​​om te worden gebruikt. Omdat alle cellen langs de dorsale-ventrale as worden afgebeeld binnen een confocale Z-plane, onze methode zorgt voor een precieze meting en vergelijking van fluorescente signalen zonder fotobleken of lichtverstrooiing gebruikelijk om 3D-reconstructies van lengterichting gemonteerde embryo&#39;s.

Watch this Scientific Journal Video about Upright Imaging of Drosophila Embryos at JoVE.com

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Hier presenteren wij een montage protocol voor gebrandschilderde<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s in een rechtopstaande positie die beeldvorming van doorsneden met behulp van confocale microscopie mogelijk maakt.

Rechtop beeldvorming van Drosophila Embryo&#39;s

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

De voorbereiding van Neuronale Culturen van Midgastrula Stage Drosophila embryo&#39;s

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

De voorbereiding van Drosophila Embryo&#39;s voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Oogsten en voorbereiden Drosophila Embryo&#39;s voor elektrofysiologische opname en andere procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

De voorbereiding van embryo&#39;s voor Elektronenmicroscopie van de Drosophila Embryonale hart buis

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Live-dissectie van Drosophila Embryo&#39;s: Gestroomlijnde methoden voor het screenen Mutant Collections door antilichaam kleuring

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo Centrifugeren van Drosophila embryo&#39;s

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Primaire celculturen van Drosophila Gastrula Embryo&#39;s

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi Interferentie door dsRNA Injectie in Drosophila Embryo&#39;s

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Cel Vorm wijzigen in Living Drosophila Embryo&#39;s

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolatie en zuivering van kinesine uit Drosophila Embryo&#39;s

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...