Name: upright imaging of drosophila embryos
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00
Duration: 7 min 34 s
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लेखक दबोरा हैरिस और डेनिएल मकाय करने के लिए विशेष रूप से ऋणी हैं. इस काम के लिए समर्थन जीवविज्ञान और कला और CWRU के विज्ञान के कॉलेज के विभाग द्वारा प्रदान की गई थी, और HHMI जैविक विज्ञान में स्नातक की शिक्षा के समर्थन के लिए अनुदान संख्या 52005866 से.

1. इमेजिंग पद्धति <ol><li> ग्लिसरीन जेली एक 55 ° 20-30 मिनट के लिए सी डिग्री पानी के स्नान में जब तक यह एक समरूप तरल हो जाता है पिगलो. , भंवर, लेकिन बुलबुले के गठन से बचने की बोतल हिला नहीं करते. </li><li> जबकि जेली पिघला देता है, एक साफ कांच स्लाइड (वैकल्पिक) पर एक Kimwipe का उपयोग कर ग्लिसरॉल की एक पतली परत लागू होते हैं. </li><li> पिपेट पिघला ग्लिसरीन का 1 से 1.5 एमएल जेली स्लाइड की सतह पर एक कट P1000 विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए एक पतली पहली परत बनाने. सावधानी पिपेट बुलबुले से बचने के के लिए. </li><li> जेली जमना एक क्षैतिज सतह पर 5 मिनट के लिए, तो -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए स्लाइड और जगह भ्रूण संरेखण के लिए आगे बढ़ना. वैकल्पिक रूप से, सरन लपेटें के साथ स्लाइड कवर और 4 ° C पर यह 5 दिनों के लिए जगह है. </li><li> 70% ग्लिसरॉल / पीबीएस जेली बिस्तर के किनारे पर या अन्य ग्लिसरॉल आधारित antifade बढ़ते मीडिया (जैसे Slowfade या Vectashield) में दाग भ्रूण की एक छोटी सी बूंद पिपेट. </li><li> व्यक्तिगत जेली सतह के लिए ड्रॉप से ​​उन्हें स्थानांतरित द्वारा भ्रूण पूर्व aligning शुरू करो. उन्हें स्थानांतरण एक slanted चमड़े के नीचे सुई का उपयोग करते हुए, एक चम्मच के रूप में slanted पक्ष का उपयोग. </li><li> मोटे तौर पर 2 से 3 कॉलम के साथ भ्रूण जगह. यदि एक भ्रूण सुई में अटक जाता है, यह अन्य भ्रूण इसे रिलीज करने के लिए युक्त बूंद में हलचल. ध्यान से उन्हें इस बिंदु पर aligning समय बर्बाद मत करो. स्तंभों के बीच कुछ जगह छोड़ें. </li><li> उन्हें क्षैतिज चमड़े के नीचे सुई की सहायता के साथ जेली मध्यम पर फिसलने से भ्रूण संरेखित करें. जबकि फिसलने, एक ही दिशा में सिर और पूंछ उन्मुख. उन्हें स्तंभ के साथ एक दूसरे के समानांतर. पीबीएस ग्लिसरॉल से अधिक निकालें मुड़ Kimiwipe का एक टुकड़ा के साथ एक पगडंडी के रूप में छोड़ दिया है. नोट: अतिरिक्त ग्लिसरॉल कारण भ्रूण शिथिल encased जेल के भीतर हो, दो जेली परतों की जुदाई में जिसके परिणामस्वरूप, यह मुश्किल में कटौती और माउंट बनाने. इसके विपरीत, बहुत ग्लिसरॉल हटाने सूखी और भ्रूण को समतल करना होगा. </li><li> भ्रूण (50-150 μL, कितने गठबंधन थे के आधार पर) पर जेली की एक पतली परत फैल कटौती पीले टिप का उपयोग. </li><li> -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 10-20 मिनट के लिए प्लेस स्लाइड या यह 4 डिग्री सेल्सियस रात भर दुकान. सुनिश्चित करें कि जेली काटने से पहले पूरी तरह से कठोर है. अन्यथा, भ्रूण के ब्लॉक आबकारी करने के लिए बहुत मुश्किल हो जाएगा. अगले दिन काटने के लिए सर्वश्रेष्ठ परिणाम प्राप्त कर रहे हैं. </li><li> एक विदारक गुंजाइश के तहत, एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें जेली के माध्यम से पूरी तरह से गठबंधन भ्रूण के दोनों पक्षों पर कटौती. एक 90 ° करने के लिए सीधे कटौती करने के कोण पर धार पकड़ो. कटौती भ्रूण की पूर्वकाल और कूल्हों डंडे के लिए बहुत करीब है कि इमेजिंग में बाधा डालती सकता है अतिरिक्त जेली से बचने के लिए किया जाना चाहिए. </li><li> ठंड पीबीटी (4 ° सी, पीबीएस 0.1% के बीच 20) में कटौती और सावधानी से एक रंग का उपयोग भ्रूण के बीच जेली परिमार्जन करने के लिए अगले. 100-200 μL जोड़ें नोट: पीबीटी में डिटर्जेंट जेली के भ्रूण को नुकसान पहुँचाए बिना स्लाइड से हटाने में मदद करता है. </li><li> एक सुई का प्रयोग, आगे काटने के लिए एक साफ स्लाइड एम्बेडेड भ्रूण के साथ जेली के ब्लॉक हस्तांतरण. 5-7 भ्रूण के साथ छोटे ब्लॉकों कट. पीबीटी का प्रयोग करें आसानी से जेली खण्ड के चारों ओर स्थानांतरित. वैकल्पिक रूप से, एक सूखी कांच की सतह पर ब्लॉक जगह इसे गिलास है, जो ठीक जेली trimming, यदि आवश्यक करने के लिए और अधिक स्थिरता पैदा करने के लिए देते हैं. </li><li> ईमानदार एक रेजर ब्लेड और एक सुई की सहायता के साथ जेली में एम्बेडेड भ्रूण पलटें. खुर्दबीन के नीचे दृश्य के लिए, नीचे दो चरणों के या तो एक के साथ आगे बढ़ना है, माइक्रोस्कोप के प्रकार पर निर्भर करता है खड़े इस्तेमाल किया जा रहा है. </li><li> उल्टे माइक्रोस्कोप: जगह एक ईमानदार स्थिति में भ्रूण के साथ एक लंबे coverslip पर भ्रूण ब्लॉक, समाप्त. सुनिश्चित करें कि जेली के कम से कम राशि के साथ भ्रूण की ओर उद्देश्य के साथ घनिष्ठ संपर्क में हो जाएगा. </li><li> ईमानदार माइक्रोस्कोप: चार # 1 superglue के साथ सरेस से जोड़ा हुआ करने के लिए &quot;का समर्थन करता है&quot; के रूप में इस्तेमाल किया जा और &quot;का समर्थन करता है&quot; के बीच में ग्लिसरॉल में भ्रूण ब्लॉक जगह coverslips के साथ दो ढेर बनाने. एक लंबे समय coverslip का उपयोग ढेर ब्रिज. </li><li> Confocal विश्लेषण के लिए, पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा उद्देश्यों की दूरी काम की जांच करने के लिए कि क्या आप छवि भ्रूण के माध्यम से सभी तरह से कर सकते हैं या केवल आंशिक रूप से. उदाहरण के लिए डी. मेलानोगास्टर भ्रूण ~ 0.55 मिमी की लंबाई में है और पूरी तरह से एक Zeiss 20x योजना ए पी ओ या एक 40x LD नव Fluor उद्देश्य का उपयोग imaged कर सकते हैं. निम्नलिखित वेबसाइट पर उपलब्ध Zeiss के उद्देश्यों पर जानकारी है और आप काम कर दूरी के अनुसार उद्देश्यों की खोज करने का विकल्प देता है: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. प्रतिनिधि परिणाम क्योंकि भ्रूण बरकरार रह गए हैं, इस विधि भ्रूण का आकार और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के बीच दूरी की सटीक माप लेने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 1 में, हम एक blastoderm मंच परमाणु दाग (नीला) DAPI, विरोधी पृष्ठीय प्रोटीन (लाल), एसओजी mRNA (पीला) और sna mRNA (हरा) के साथ दाग भ्रूण दिखा . Morphological प्रोसेसरसत्र, mesoderm के invagination (चित्रा 2A, बी) और mesodermal कोशिकाओं (चित्रा 3 और 4) के प्रवास के रूप में ऐसे भी देखे जा इस पद्धति का उपयोग कर सकते हैं. विभिन्न DV अक्ष के साथ Z-पदों फोकल हवाई जहाज़ को बदलने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में 2-4 आंकड़े में दिखाया गया है. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="चित्रा 1" /> चित्रा 1. ईमानदार blastoderm चरण में एक अक्षुण्ण भ्रूण के ऑप्टिकल टुकड़ा mRNA और प्रोटीन के लिए डबल धुंधला हो जाना. . सीटू जांच (एसओजी sna) और प्राथमिक एंटीबॉडी (विरोधी पृष्ठीय) द्वारा दाग प्रोटीन लक्ष्य mRNAs आकृति में संकेत कर रहे हैं. DAPI नाभिक लेबल इस्तेमाल किया गया था. ध्यान दें कि एसओजी और sna की अभिव्यक्ति apically cytoplasm में स्थित हैं, जबकि पृष्ठीय की अभिव्यक्ति परमाणु है . एसओजी नवजात टेप है कि नाभिक में स्थित हैं से मजबूत संकेतों भी इस बढ़ाई पर देखा जा सकता है . <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="चित्रा 2" /> चित्रा 2. एक अक्षुण्ण gastrulating भ्रूण के ईमानदार इमेजिंग. MRNA जांच का इस्तेमाल किया और उनके संबंधित रंग आंकड़ा में संकेत कर रहे हैं. एक) ध्यान दें कि इस चरण में, तीन जीनों वही fluor (sna, एसओजी और DPP हरे रंग में) के साथ दाग spatially अलग डोमेन में व्यक्त कर रहे हैं. invaginating mesoderm sna व्यक्त किया, neuroblast परत इंडस्ट्रीज़ व्यक्त बाह्य त्वक स्तर और DPP व्यक्त किया, जबकि एसओजी अभिव्यक्ति तंत्रिका तंत्र के उदर क्षेत्रों में अभी भी मौजूद है . बी) एक ही भ्रूण की एक गहरी confocal विमान में, हम invaginating mesoderm के आधार नोट जोरदार sna व्यक्त, लेकिन अपने शिखर क्षेत्र में निचले स्तर पर व्यक्त . <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="चित्रा 3" /> चित्रा 3. घोंघा, इंडस्ट्रीज़ और DPP mRNAs (हरा), पृष्ठीय प्रोटीन (लाल); SOG रोगाणु बैंड के साथ एक अक्षुण्ण भ्रूण के ईमानदार इमेजिंग (पीला) शाही सेना बढ़ाया. नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग थे. भ्रूण सिर के पास एक) नाभीय विमान है. बी) एक ही भ्रूण के ट्रंक क्षेत्र में एक और फोकल हवाई जहाज़. पार्श्व प्रवास से पहले mesodermal कोशिकाओं (चित्रा 4 तुलना) उदर midline पास एक रोगाणु बैंड विस्तारित भ्रूण के दोनों पक्षों पर झूठ बोल के नोट जन. Delaminating neuroblasts हरे (इंडस्ट्रीज़ और sna) में चिह्नित कर रहे हैं. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="चित्रा 4" /> चित्रा 4. ईमानदार रोगाणु बैंड विस्तार के दौरान एक अक्षुण्ण भ्रूण के इमेजिंग SOG शाही सेना (पीला), घोंघा, इंडस्ट्रीज़ और DPP mRNAs (हरा), पृष्ठीय प्रोटीन (लाल). ए) उपकला (तीर) से delaminating neuroblasts नोट इंडस्ट्रीज़ और sna के लिए इस मंच (हरा) पर दोनों दाग. भी वेंट्रल midline (पीला) के लिए एसओजी को प्रतिबंधित अभिव्यक्ति ध्यान दें . इस चरण में DPP की अभिव्यक्ति भ्रूण (तारांकन) के पार्श्व पक्षों में देखा जा सकता है . बी) एक ही भ्रूण में ऑप्टिकल अनुभाग भ्रूण की लंबाई, जो मध्य पीछे क्षेत्र के लिए संगत के अंत के पास में दिखाया गया है. उदर midline कोशिकाओं एसओजी के लिए दाग रहे हैं.

<ol>
	<li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos.">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li><li>Gr&#946;hans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila.">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li><li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol.">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li><li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila.">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

ड्रोसोफिला भ्रूण के पार अनुभाग छवियों लेना, चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि यह या तो 2 स्लाइस या सूक्ष्म तक्षणी प्रसंस्करण, जो आम तौर पर होता है फ्लोरोसेंट stainings के लिए हानिकारक के लिए एम्बेडेड मीडिया के उपयोग के एक सावधान हाथ विच्छेदन की आवश्यकता है. वैकल्पिक रूप से, एक confocal खुर्दबीन में बने Z-ढेर पार अनुभाग छवियों के 3D पुनर्निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, यह समय लगता है एक सटीक 3D पुनर्निर्माण और photobleaching problematical हो जाता है के लिए कई पतली स्लाइस Confocal है. एक और चिंता का विषय है जब इमेजिंग भ्रूण कि longitudinally बढ़ रहे हैं प्रकाश बिखरने है कि तब होता है जब भ्रूण है, जो भी संकेतों के फ्लोरोसेंट प्रोटीन या mRNA अभिव्यक्ति 1 स्तर की मात्रा का ठहराव के उद्देश्य के लिए सटीक माप लेने पेचीदा गहरी वर्गों तक पहुँचने है. यहां तक ​​कि एक दो photon confocal खुर्दबीन के साथ, प्रकाश बिखरने अभी भी एक भ्रूण है, जो तक ही सीमित होना करने के लिए नमूने के इष्टतम पारदर्शिता के लिए बढ़ते मीडिया का चयन करता है के बीच में जर्दी सामग्री की अस्पष्टता के कारण चिंता का विषय है. इन समस्याओं को दरकिनार करने के लिए, एक नया &quot;अंत पर स्थिति भ्रूण की इमेजिंग तकनीक बुलाया खड़ी हाल ही में दोनों रहते हैं और अचल नमूने 4 छवि के लिए विकसित किया गया था. इस पत्र में, हम खड़ी घुड़सवार भ्रूण के लिए एक नए प्रोटोकॉल है कि अनुमति देता है एक सरल और किसी भी आकार और आकार है कि कई के साथ स्वस्थानी 3 जांच में दाग तय भ्रूण या ऊतकों की तैयारी दृश्य विकसित की है. हमारी विधि पतला संगति के साथ एक बढ़ते मीडिया है कि इसके भीतर गठबंधन भ्रूण डिब्बे में बंद करने के लिए प्रयोग किया जाता है का उपयोग करने के होते हैं. इस बढ़ते एम्बेडेड भ्रूण युक्त मीडिया के कट ब्लॉक Confocal खुर्दबीन के किसी भी प्रकार में इमेजिंग पहले तैनात ईमानदार हो सकते हैं. जेली में भ्रूण एम्बेडिंग और उन्हें स्थिति खड़ी करके, हम क्षैतिज पार वर्गों ले confocal माइक्रोस्कोपी, जिसमें भ्रूण के उदर अक्ष पृष्ठीय साथ कोशिकाओं को एक साथ प्रस्तुत कर रहे हैं का उपयोग कर रहे हैं. यह प्रकाश बिखरने और फ्लोरोसेंट रंजक है कि longitudinally घुड़सवार भ्रूण के पारंपरिक जेड ढेर पुनर्निर्माण में होता photobleaching अब सफाया कर रहे हैं की समस्याओं के बाद से एक मात्रा का ठहराव के प्रयोजनों के लिए महत्वपूर्ण सुधार है. इस प्रकार, जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन का स्तर पृष्ठीय - वेंट्रल अक्ष साथ की मात्रा का ठहराव सटीक है, क्योंकि विपरीत पृष्ठीय वेंट्रल पदों पर स्थित कोशिकाओं को एक ही समय में और एक ही confocal Z स्थिति पर imaged हैं. इसके अलावा, वर्णित विधि हमें एक 3 - डी भ्रूण से अक्ष पृष्ठीय उदर भर जटिल कम्प्यूटेशनल unrolling तरीकों का उपयोग करने के लिए डीवी 6 अक्ष के साथ विभिन्न पदों पर कोशिकाओं कल्पना के बिना एक पूर्ण छवि 2 - डी प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है . कुछ महत्वपूर्ण कदम भ्रूण aligning के बाद अतिरिक्त ग्लिसरॉल हटाने, जेली की दो परतों के बीच विभाजन से बचने के शामिल हैं. हालांकि, अगर नमूना भी निर्जलित है, जिसके परिणामस्वरूप छवि कुरूप हो सकता है और गलत आकारिकी है. इसके अलावा, अगर भ्रूण के आसपास जेली मध्यम सीधे के बजाय एक कोण पर काटा जाता है, जिसके परिणामस्वरूप छवि कम दौर और अधिक ovular आकार में, एक 90 डिग्री के अलावा अन्य कोण पर एक भ्रूण के गलत स्थिति के कारण प्रकट हो सकता है. अंत में, अगर जेली पर्याप्त निकट पूर्वकाल / पीछे समाप्त होता है पर भ्रूण में कटौती नहीं है, यह संभव है क्योंकि उद्देश्य की दूरी काम मुख्य रूप से जेली और नहीं भ्रूण में ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के लिए एक उचित छवि प्राप्त नहीं है. एक अन्य महत्वपूर्ण कदम है कि आवश्यक हो सकता है जब इमेजिंग देर gastrulating भ्रूण ध्यान से गुंजाइश तहत पहले उन्हें aligning के हित के चरणों तरह हो सकता है. आमतौर पर, भ्रूण morphological विशेषताओं है कि सबसे अधिक आसानी से जब एक अनुदैर्ध्य स्थिति में मान्यता प्राप्त कर सकते हैं अनुसार मंचन कर रहे हैं. वैकल्पिक संशोधनों है कि इस विधि के साथ बनाया जा सकता है है के अलावा जेली फ्लोरोसेंट रंजक के photobleaching के खिलाफ की रक्षा करने में मदद की दूसरी परत में एक विरोधी फीका अभिकर्मक (जैसे पी Phenylenediamine या पीपीडी) शामिल है.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycerin Jelly mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences Company</td>
<td>17998-10</td>
<td>Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss LSM 700 Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-544-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72204-02</td>
<td>Size 1 &frac12; (specific for the objectives used in this work).</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slips (for making supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherfinest</td>
<td>12-544-10</td>
<td>Use four coverslips glued with superglue. </td>
</tr>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td>
<td>M420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Steel back single edge industrial blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>21-401-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hypodermic needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>1482610</td>
<td>26 Gauge</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

upright imaging of drosophila embryos

कई प्रसिद्ध morphogenetic gradients और सेलुलर आंदोलनों के पृष्ठीय / वेंट्रल अक्ष के साथ होते हैं<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण. हालांकि, मौजूदा ऐसी प्रक्रियाओं को देखने के लिए तकनीक का इस्तेमाल कुछ हद तक सीमित हैं. निम्नलिखित प्रोटोकॉल तय बढ़ते है और लेबल के लिए एक नई तकनीक का वर्णन<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण confocal इमेजिंग के साथ राज्याभिषेक देखने के लिए. इस विधि ग्लिसरीन जेली बढ़ते मीडिया की दो परतों के बीच भ्रूण एम्बेड के होते हैं, और इमेजिंग जेली स्ट्रिप्स ईमानदार तैनात है. भ्रूण sandwiching के लिए पहले कदम के लिए एक स्लाइड पर ग्लिसरीन जेली की पतली बिस्तर बनाने के लिए है. अगला, भ्रूण को ध्यान से इस सतह पर जुड़ रहे हैं और जेली का एक दूसरे परत के साथ कवर किया. बाद दूसरी परत जम है, जेली के स्ट्रिप्स काट रहे हैं और ईमानदार इमेजिंग के लिए रूप से फ़्लिप. वैकल्पिक के लिए इस्तेमाल किया जा खुर्दबीन स्टैंड के प्रकार पर निर्भर करता है भ्रूण को दृश्यमान करने के लिए वर्णित कर रहे हैं. चूंकि पृष्ठीय - वेंट्रल अक्ष के साथ सभी कोशिकाओं को एक एकल confocal Z विमान के भीतर imaged हैं, हमारे विधि photobleaching या प्रकाश longitudinally घुड़सवार भ्रूण के 3D पुनर्निर्माण के लिए आम बिखरने के बिना सटीक माप और फ्लोरोसेंट संकेतों की तुलना की अनुमति देता है.

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Upright Imaging of Drosophila Embryos

हम यहाँ मौजूद दाग के लिए एक बढ़ते प्रोटोकॉल<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण है कि पार वर्गों confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग की इमेजिंग की अनुमति देता है एक ईमानदार स्थिति में है.

के ईमानदार इमेजिंग ड्रोसोफिला भ्रूण

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrula स्टेज ड्रोसोफिला भ्रूण से Neuronal संस्कृति की तैयारी

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

की तैयारी ड्रोसोफिला लाइव इमेजिंग के लिए भ्रूण हैंगिंग ड्रॉप प्रोटोकॉल का उपयोग करना

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

संचयन एवं तैयारी ड्रोसोफिला भ्रूण electrophysiological रिकॉर्डिंग और अन्य प्रक्रियाओं के लिए

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

भ्रूण की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार ड्रोसोफिला भ्रूण दिल ट्यूब

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

के लाइव विच्छेदन ड्रोसोफिला भ्रूण एंटीबॉडी धुंधला द्वारा उत्परिवर्ती संग्रह स्क्रीनिंग के लिए सुव्यवस्थित तरीके

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

ड्रोसोफिला भ्रूण में vivo centrifugation

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

प्राथमिक सेल संस्कृति से ड्रोसोफिला गेसट्रुला भ्रूण

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

DsRNA इंजेक्शन द्वारा हस्तक्षेप आरएनएआई में ड्रोसोफिला भ्रूण

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

जहाँ रहते इमेजिंग सेल आकार बदलें ड्रोसोफिला भ्रूण

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

अलगाव और kinesin के शोधन से ड्रोसोफिला भ्रूण

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...