Name: upright imaging of drosophila embryos
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00
Duration: 7 min 34 s
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Gli autori sono particolarmente in debito con Deborah Harris e Danielle MacKay. Il supporto per questo lavoro è stato fornito dal Dipartimento di Biologia e il Collegio di Arti e Scienze di CWRU, e in base al numero 52005866 HHMI concedere per il supporto della formazione universitaria nelle scienze biologiche.

1. Metodologia di imaging <ol><li> Melt glicerina gelatina in un bagno d&#39;acqua ° 55 ° C per 20-30 minuti fino a quando diventa un liquido omogeneo. Ricciolo, ma non agitare la bottiglia per evitare la formazione di bolle. </li><li> Mentre la gelatina si scioglie, applicare un sottile strato di glicerolo con un Kimwipe su un vetrino pulito (opzionale). </li><li> Pipettare 1 a 1,5 ml di glicerina gelatina sciolta con un P1000 punta tagliata della pipetta sulla superficie del vetrino per creare un sottile strato prima. Pipettare con attenzione per evitare bolle. </li><li> Lasciate che la gelatina solidificare per 5 minuti su una superficie orizzontale, poi posto la diapositiva a -20 ° C per 5 minuti e procedere con l&#39;allineamento degli embrioni. In alternativa, coprire il vetrino con pellicola trasparente e mettetelo a 4 ° C per un massimo di 5 giorni. </li><li> Pipettare una piccola goccia di embrioni macchiato nel 70% glicerolo / PBS o altri mezzi di montaggio Antifade glicerolo-based (ad es Slowfade o Vectashield) sul lato del letto gelatina. </li><li> Iniziare pre-allineamento degli embrioni da parte individualmente di trasferirli dal menù alla superficie gelatina. Trasferirli usando un ago ipodermico inclinato, usando il lato inclinato come un cucchiaio. </li><li> Circa posto gli embrioni lungo 2-3 colonne. Se un embrione si blocca in dell&#39;ago, questo aggiungete la goccia contenente gli embrioni altri per rilasciarlo. Non perdere tempo con cura allineando a questo punto. Lascia un pò di spazio tra le colonne. </li><li> Allineare gli embrioni facendo scorrere orizzontalmente sul supporto gelatina con l&#39;ausilio dell&#39;ago ipodermico. Facendo scorrere, orientare le teste e le code nella stessa direzione. Rendili parallele tra loro lungo la colonna. Rimuovere l&#39;eccesso di glicerolo PBS lasciato come una scia con un pezzo di Kimiwipe contorto. Nota: glicerolo eccesso causerà embrioni di essere vagamente racchiusi all&#39;interno di gel, con conseguente separazione dei due strati di gelatina, il che rende difficile da tagliare e montare. Al contrario, la rimozione di glicerolo troppo si secca e appiattire embrioni. </li><li> Utilizzare una punta di giallo tagliato a diffondere un sottile strato di gelatina negli embrioni (50-150 microlitri, a seconda di quanti erano allineati). </li><li> Porre il vetrino in freezer -20 ° C per 10-20 minuti o conservarlo a 4 ° C per una notte. Assicurarsi che la gelatina è completamente rigido prima del taglio. In caso contrario, il blocco degli embrioni sarà molto difficile da accise. I migliori risultati per il taglio sono ottenuti il ​​giorno successivo. </li><li> In un ambito di dissezione, usare una lama di rasoio per tagliare completamente attraverso la gelatina su entrambi i lati degli embrioni allineate. Tenere la lama di rasoio in un angolo di 90 ° di effettuare tagli diritti. I tagli dovrebbero essere molto vicino ai poli anteriore e posteriore degli embrioni per evitare eccesso di gelatina che può ostacolare l&#39;imaging. </li><li> Aggiungere 100-200 ml di freddo PBT (4 ° C, PBS +0,1% Tween 20) accanto ai tagli e con attenzione raschiare la gelatina tra embrioni con una spatola. Nota: Il detersivo in PBT aiuta la rimozione della gelatina dalla diapositiva senza danneggiare gli embrioni. </li><li> Utilizzando un ago, il trasferimento del blocco di gelatina con embrioni incorporato a un vetrino pulito per il taglio ulteriore. Tagliare i blocchi più piccoli con embrioni 5-7. Usa PBT di muoversi facilmente intorno al blocco di gelatina. In alternativa, posizionare il blocco su una superficie di vetro asciutta per farla attaccare al vetro, che crea una maggiore stabilità proprio per tagliare la gelatina, se necessario. </li><li> Raddrizzarsi gli embrioni incorporato nel gelatina con l&#39;aiuto di una lama di un rasoio e un ago. Per la visualizzazione al microscopio, procedere con uno dei due passaggi riportati di seguito, a seconda del tipo di microscopio stare in uso. </li><li> Microscopio invertito: luogo finito blocchi embrione su un vetrino lungo, con gli embrioni in posizione verticale. Assicurarsi che il lato dell&#39;embrione con la minor quantità di gelatina sarà a più stretto contatto con obiettivo. </li><li> Microscopio verticale: fare due pile con quattro # 1 coprioggetto incollato con colla da utilizzare come &quot;supporto&quot; e posizionare il blocco embrione in glicerolo tra i &quot;supporti&quot;. Colmare il pile con un coprioggetto lungo. </li><li> Per l&#39;analisi confocale, controllare la distanza di lavoro degli obiettivi da utilizzare per sapere se è possibile immagine tutto il percorso attraverso l&#39;embrione o solo parzialmente. Per esempio, D. embrioni melanogaster hanno ~ 0,55 millimetri di lunghezza e possono essere interamente ripreso con un Zeiss 20x Plan-Apo o un 40x LD neo-Fluor obiettivo. Il sito contiene informazioni sui seguenti obiettivi Zeiss disponibili e vi dà la possibilità di ricercare gli obiettivi in ​​base alle distanze di lavoro: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Rappresentante Risultati Perché gli embrioni sono rimasti intatti, questo metodo può essere utilizzato per effettuare misurazioni precise delle dimensioni degli embrioni e distanze tra gli schemi di espressione genica. Nella Figura 1, ci mostrano una embrioni Blastoderm fase colorati con il nucleare macchia DAPI (blu), anti-dorsale delle proteine ​​(rosso), mRNA SOG (giallo) e mRNA sna (verde). Proces morfologicases, come invaginazione del mesoderma (Figura 2A, B) e la migrazione di cellule mesodermiche (Figura 3 e 4) possono anche essere visualizzati utilizzando questo metodo. Z-posizioni diverse lungo l&#39;asse DV può essere ottenuto cambiando il piano focale, come mostrato nelle Figure 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Verticale fetta ottica di un embrione intatto in fase Blastoderm. Colorazione doppia per mRNA e proteine. MRNA bersaglio per le sonde in situ (SOG e SNA) e di proteine ​​colorate con l&#39;anticorpo primario (anti-dorsali) sono indicati in figura. DAPI è stato usato per etichettare i nuclei. Si noti che l&#39;espressione di SOG e SNA si trovano nel citoplasma apicale, mentre l&#39;espressione della dorsale è nucleare. Segnali forti dalle trascrizioni sog nascente che si trovano nei nuclei può essere visto anche in questo ingrandimento. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Immagine verticale di un embrione intatto gastrulating. Sonde mRNA usato e loro rispettivi colori sono indicate in figura. A) Si noti che in questa fase, tre geni colorati con lo stesso fluoro (sna, SOG e DPP, in verde), sono espressi in domini separati spazialmente. Il mesoderma invaginating esprime sna, lo strato di neuroblasti esprime ind e l&#39;ectoderma esprime dpp, mentre l&#39;espressione sog è ancora presente nelle regioni ventrale del sistema nervoso. B) In un piano più profondo confocale dell&#39;embrione stesso, si nota la base del mesoderma invaginating esprime fortemente sna, ma la sua regione apicale esprime livelli più bassi. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Immagine verticale di un embrione intatto con la band di germe esteso sog RNA (giallo);. Lumaca, ind e mRNA DPP (verde), proteine ​​dorsali (rosso). I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). A) sul piano focale vicino alla testa dell&#39;embrione. B) Un altro piano focale nella regione del tronco dell&#39;embrione stesso. Massa nota di cellule mesodermiche prima della migrazione laterale (confronta con Figura 4) aderente alla linea mediana ventrale su entrambi i lati di un germe-band embrione esteso. Neuroblasti delaminazioni sono etichettati in verde (ind e SNA). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Immagine verticale di un embrione intatto durante l&#39;estensione di germe di banda sog RNA (giallo);. Lumaca, ind e mRNA DPP (verde), proteine ​​dorsali (rosso). A) Si noti la neuroblasti delaminazioni dal epitelio (freccia), macchiato sia per ind e SNA in questa fase (verde). Si noti anche l&#39;espressione ristretto di SOG alla linea mediana ventrale (giallo). Espressione di DPP in questa fase può essere visto facce laterali dell&#39;embrione (asterisco). B) sezione ottica nell&#39;embrione stesso mostrato in A verso la fine della lunghezza dell&#39;embrione, che corrisponde alla metà posteriore regione. Le cellule della linea mediana ventrale sono macchiati di sog.

<ol>
	<li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos.">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li><li>Gr&#946;hans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila.">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li><li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol.">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li><li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila.">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Prendendo immagini sezione di embrioni di Drosophila può essere impegnativo, perché richiede sia una dissezione accurata mano di fette di 2 o l&#39;uso dei mezzi di comunicazione embedded per l&#39;elaborazione microtomo, che di solito è dannoso per colorazioni fluorescenti. In alternativa, Z-stack fatto in un microscopio confocale può essere usato per fare la ricostruzione 3D della sezione immagini. Tuttavia, è tempo di fare varie fette sottili confocale per una accurata ricostruzione 3D e photobleaching diventa problematico. Un&#39;altra preoccupazione quando gli embrioni di imaging che sono montati longitudinalmente è la dispersione della luce che si verifica quando si raggiunge più sezioni dell&#39;embrione, che complica anche le misurazioni precise dei segnali fluorescenti a fini di quantificazione dei livelli di espressione della proteina o di mRNA 1. Anche con un microscopio a due fotoni confocale, dispersione della luce è ancora una preoccupazione a causa della opacità del materiale tuorlo al centro dell&#39;embrione, che fa selezione di supporti di montaggio per la massima trasparenza del campione a essere limitata. Per aggirare questi problemi, una nuova tecnica di imaging chiamata &quot;End-on&quot; degli embrioni posizionamento in verticale è stato recentemente sviluppato per l&#39;immagine sia dal vivo che i campioni fisso 4. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per gli embrioni montate verticalmente che permette una semplice preparazione e la visualizzazione di embrioni fisso o tessuti di qualsiasi dimensione e forma che si sono macchiati con più sonde in situ 3. Il nostro metodo consiste nell&#39;utilizzare un supporto di montaggio con consistenza gelatinosa che viene usato per racchiudere gli embrioni allineati al suo interno. Blocchi tagliati di questo mezzo di montaggio contenente gli embrioni incorporato può essere posizionato in posizione verticale prima immagine in qualsiasi tipo di microscopio confocale. Integrando gli embrioni in gelatina e il posizionamento in verticale, siamo in grado di prendere orizzontale sezioni usando la microscopia confocale, in cui vengono presentati cellule lungo il dorso-ventrale asse dell&#39;embrione contemporaneamente. Questo è un miglioramento significativo ai fini quantificazione perché i problemi di dispersione della luce e photobleaching di coloranti fluorescenti che si verifica in convenzionale Z-stack ricostruzione di embrioni montato longitudinalmente sono ora eliminati. Così, la quantificazione dei livelli di espressione del gene o della proteina lungo l&#39;asse dorso-ventrale è preciso, dal momento che le cellule situato di fronte dorso-ventrale posizioni sono esposte nello stesso momento e nello stesso tempo confocale Z-posizione. Inoltre, il metodo descritto permette di ottenere una completa immagine 2-D in tutto il dorso-ventrale asse da un 3-D embrione senza l&#39;utilizzo di complessi metodi computazionali svolgimento di visualizzare le cellule in posizioni diverse lungo l&#39;asse DV 6. Alcuni dei passaggi critici includere la rimozione glicerolo in eccesso dopo l&#39;allineamento degli embrioni, per evitare di dividere tra i due strati di gelatina. Tuttavia, se il campione è troppo disidratato, l&#39;immagine risultante sarà deformi e hanno una morfologia corretta. Inoltre, se il mezzo gelatina intorno l&#39;embrione viene tagliato con un angolo piuttosto che direttamente, l&#39;immagine risultante può apparire meno rotondo e più in forma ovulare, a causa di un non corretto posizionamento degli embrioni a un angolo di 90 gradi. Infine, se la gelatina non viene tagliato strettamente sufficiente per l&#39;embrione sulle estremità anteriore / posteriore, non è possibile ottenere una immagine corretta distanza di lavoro, perché l&#39;obiettivo sarebbe stato utilizzato principalmente per concentrarsi nella gelatina e non l&#39;embrione. Un altro passo importante che può essere necessaria quando l&#39;imaging embrione gastrulating fine è quello di ordinare con attenzione le fasi di interesse nell&#39;ambito di applicazione prima di allineare loro. Di solito, gli embrioni sono messo in scena in base alle caratteristiche morfologiche che possono essere più facilmente riconoscibile quando è in posizione longitudinale. Tra le modifiche alternativi che possono essere fatte con questo metodo è quello di includere un anti-fade reagente (ad esempio p-fenilendiammina o PPD) nel secondo strato di gelatina per aiutare a proteggere contro photobleaching di coloranti fluorescenti.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycerin Jelly mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences Company</td>
<td>17998-10</td>
<td>Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss LSM 700 Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-544-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72204-02</td>
<td>Size 1 &frac12; (specific for the objectives used in this work).</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slips (for making supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherfinest</td>
<td>12-544-10</td>
<td>Use four coverslips glued with superglue. </td>
</tr>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td>
<td>M420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Steel back single edge industrial blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>21-401-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hypodermic needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>1482610</td>
<td>26 Gauge</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

upright imaging of drosophila embryos

Alcuni noti gradienti morfogenetici e movimenti cellulari si verificano lungo l&#39;asse dorsale / ventrale della<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrione. Tuttavia, le attuali tecniche utilizzate per visualizzare tali processi sono piuttosto limitate. Il protocollo che segue descrive una nuova tecnica per il montaggio fisso ed etichettato<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni per la visualizzazione coronale con imaging confocale. Questo metodo consiste di incorporamento embrioni tra due strati di glicerina mezzi gelatina di montaggio, e di imaging strisce di gelatina in posizione eretta. Il primo passo per sandwiching gli embrioni è di fare un sottile letto di glicerina gelatina in una diapositiva. Successivamente, gli embrioni vengono accuratamente allineati su questa superficie e coperto con un secondo strato di gelatina. Dopo il secondo strato è solidificato, strisce di gelatina vengono tagliate e capovolto in posizione verticale per l&#39;imaging. Alternative sono descritte per la visualizzazione degli embrioni a seconda del tipo di stand microscopio da utilizzare. Dal momento che tutte le cellule lungo l&#39;asse dorso-ventrale sono esposte all&#39;interno di un singolo confocale Z-plane, il nostro metodo permette misurazioni precise e il confronto dei segnali fluorescenti senza photobleaching o dispersione della luce comune a ricostruzioni 3D di embrioni montato longitudinalmente.

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Upright Imaging of Drosophila Embryos

Qui vi presentiamo un protocollo di montaggio per macchiato<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni in posizione verticale che permette l&#39;imaging di sezioni trasversali usando la microscopia confocale.

Imaging verticale di Drosophila Embrioni

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

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Biologia

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Raccolta e Preparazione Drosophila Gli embrioni per la registrazione elettrofisiologici e altre procedure

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Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Dissezione di vivere Drosophila Embrioni: Metodi semplificati per lo screening Collezioni Mutant dalla colorazione anticorpale

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo centrifugazione di embrioni di Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Colture cellulari primarie da Drosophila Gastrula embrioni

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

L&#39;interferenza di RNAi per iniezione in dsRNA Drosophila Embrioni

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Forma Modifica cella in Living Drosophila Embrioni

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...