Name: upright imaging of drosophila embryos
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Upright Imaging of Drosophila Embryos at JoVE.com

Författarna är speciellt skuld till Deborah Harris och Danielle MacKay. Stöd för detta arbete lämnades av Institutionen för biologi och College of Arts and Sciences i CWRU, och genom HHMI licensnummer 52005866 för stöd till grundutbildning inom de biologiska vetenskaperna.

1. Imaging Metodik <ol><li> Smält glycerin gelé i en 55 ° C grader vattenbad i 20-30 minuter tills det blir en homogen vätska. Swirl, men inte skaka flaskan för att undvika uppkomsten av bubblor. </li><li> Medan gelé smälter, applicera ett tunt skikt av glycerol med en Kimwipe på en ren glasskiva (tillval). </li><li> Pipettera över 1 till 1,5 ml av smält glycerin med gelé ett snitt spets P1000 pipett på ytan på bilden för att skapa en tunn första skiktet. Pipettera noggrant för att undvika bubblor. </li><li> Låt gelé stelna i 5 minuter på en horisontell yta, placera sedan bilden vid -20 ° C i 5 min och gå vidare till embryo justering. Alternativt kan täcka bilden med Saran Wrap och placera den i 4 ° C i upp till 5 dagar. </li><li> Pipettera en liten droppe av målat embryon i 70% glycerol / PBS eller andra antifade glycerol-baserade montering medier (t.ex. Slowfade eller Vectashield) på sidan av gelé sängar. </li><li> Börja redan rikta embryon genom individuellt överföra dem från drop till gelé ytan. Överföra dem med hjälp av ett lutande injektionsnål, med sneda sidan som en sked. </li><li> Ungefär plats embryona längs 2 till 3 kolumner. Om ett embryo fastnar i nålen, rör om i droppen som innehåller andra embryon för att frigöra det. Slösa inte tid noggrant anpassa dem på denna punkt. Lämna lite utrymme mellan kolumnerna. </li><li> Rikta in embryon genom att skjuta dem horisontellt på gelé mediet med hjälp av injektionsnålen. Medan glidande, Orient för krona och klave i samma riktning. Gör dem parallellt med varandra längs kolumnen. Avlägsna överskott av PBS glycerol kvar som ett spår med en bit tvinnad Kimiwipe. Notera: Överskott glycerol orsakar embryon löst inneslutet inom gelé, vilket resulterar i separation av de två gelé lager, vilket gör det svårt att skära och montera. Omvänt kommer att ta bort för mycket glycerol torra och platta embryon. </li><li> Använd ett snitt gul spets för att sprida ett tunt lager av gelé över embryon (50 till 150 mikroliter, beroende på hur många som var anpassade). </li><li> Placera bilden i -20 ° C frys i 10-20 min eller lagra den vid 4 ° C över natten. Se till att gelé är helt stel innan kapning. Annars kommer blocket av embryon vara mycket svårt att punktskatter. Bästa resultat för skärning erhålls på följande dag. </li><li> Enligt en dissekera omfattning, använda ett rakblad för att skära helt igenom gelé på båda sidor av anpassad embryon. Håll rakbladet i 90 ° vinkel för att göra raka snitt. Nedskärningarna ska göras mycket nära främre och bakre stolpar av de embryon som förhindrar alltför stora gelé som kan hindra avbildning. </li><li> Tillsätt 100-200 mikroliter av kall PBT (4 ° C, PBS 0,1% Tween 20) bredvid nedskärningar och försiktigt skrapa bort gelé mellan embryon med hjälp av en spatel. Obs: diskmedel i PBT hjälper avlägsnande av gelé från bilden utan att skada embryon. </li><li> Med hjälp av en nål, överföra block av gelé med inbäddade embryon till en ren bild för vidare bearbetning. Skär mindre block med 5-7 embryon. Använd PBT att enkelt flytta runt i gelé blocket. Alternativt, placera block på en torr glasyta att låta det fäster vid glaset, vilket skapar mer stabilitet för just trimma gelé, om det behövs. </li><li> Vänd upprätt embryona inbäddad i gelé med hjälp av ett rakblad och en nål. För visualisering under mikroskop, gå vidare med något av de två stegen nedan beroende på vilken typ av mikroskop monter som används. </li><li> Inverterat mikroskop: placera färdiga embryot block på en lång täckglas med embryon i upprätt position. Se till att den sida av embryot med minsta mängd gelé kommer i närmare kontakt med målet. </li><li> Upprätt mikroskop: göra två högar med fyra # 1 täckglas limmade med superlim för att användas som &quot;stöder&quot; och placera embryot blocket i glycerol i mellan &quot;stöd&quot;. Överbrygga högar med hjälp av en lång täckglas. </li><li> För konfokala analys, kontrollera arbetsavstånd av de mål som ska användas för att ta reda på om du kan bilden hela vägen genom embryot eller endast delvis. Till exempel D. melanogaster embryon har ~ 0,55 mm i längd och kan vara helt avbildas med en Zeiss 20x Plan-Apo eller en 40x LD Neo-Fluor mål. Följande hemsida har information om tillgängliga Zeiss mål och ger dig möjlighet att söka mål i enlighet med arbetsavstånd: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Representativa resultat Eftersom embryona finns kvar intakt, kan denna metod användas för att ta exakta mätningar av embryots storlek och avstånd mellan mönster genuttryck. I Figur 1 visar vi ett embryon BLASTODERM skede färgas med den nukleära fläcken DAPI (blå), anti-ryggfenan protein (röd), SOG mRNA (gul) och SNA mRNA (grön). Morfologiska procesSES kan t.ex. invagination av mesoderm (Figur 2A, B) och migration av mesodermal celler (Figur 3 och 4) också visualiseras med denna metod. Olika Z-positioner längs DV-axeln kan erhållas genom att ändra fokalplanet, som visas i figurerna 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Upprätt optisk skiva av en intakt embryo i BLASTODERM skede. Dubbelklicka färgning av mRNA och protein. Mål mRNA för in situ-sonder (SOG och SNA) och protein färgas av primär antikropp (anti-ryggfenan) indikeras i figuren. DAPI användes för att märka kärnor. Observera att uttrycket av SOG och SNA finns apikalt i cytoplasman, medan uttrycket av ryggfenan är kärnkraft. Starka signaler från SPM begynnande avskrifter som finns i atomkärnor kan också ses på denna förstoring. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Upprätt avbildning av en intakt gastrulating embryo. MRNA prober som används och dessa har olika färger anges i figuren. A) Observera att i detta skede, tre gener färgade med samma Fluor (SNA, SOG och DPP, i grönt), uttrycks i rumsligt åtskilda domäner. Den invaginating mesoderm uttrycker SNA uttrycker neuroblast lagret ind och ektoderm uttrycker DPP, medan SPM Uttrycket förekommer fortfarande i ventrala delar av nervsystemet. B) I en djupare konfokala plan av samma embryo konstaterar vi basen av invaginating mesoderm starkt uttryck för SNA, men dess apikala regionen uttrycker lägre nivåer. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Upprätt avbildning av en intakt embryo med groddar bandet förlängd SPM RNA (gul),. Snigel, ind och mRNA DPP (grön), ryggfenan protein (röd). Kärnor färgades med DAPI (blå). A) fokalplan nära embryo huvudet. B) En annan fokalplanet i bagageluckan regionen samma embryo. Notera massa mesodermal celler innan laterala migration (jämför Figur 4) ligger nära den ventrala mittlinjen på båda sidor av en bakterie-band längre embryo. Formförändras neuroblaster är märkta i grönt (IND och SNA). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. Upprätt avbildning av en intakt embryo under groddar bandet förlängning SPM RNA (gul),. Snigel, ind och mRNA DPP (grön), ryggfenan protein (röd). A) Lägg märke till delaminering neuroblaster från epitelet (pilen), färgade både ind och SNA i detta skede (grön). Notera också den begränsade uttryck för SPM att den ventrala mittlinjen (gul). Redovisning av DPP i detta skede kan ses på laterala sidor av embryot (asterisk). B) Optisk avsnitt i samma embryot visas i en nära slutet av embryot längd, vilket motsvarar mitten av posteriora regionen. Den ventrala mittlinjen cellerna färgas för SOG.

<ol>
	<li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos.">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li><li>Gr&#946;hans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila.">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li><li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol.">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li><li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila.">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li></ol>

Med tvärsnitt bilder av Drosophila embryon kan vara en utmaning eftersom det kräver antingen en försiktig hand dissekering av skivor 2 eller användning av inbäddade medier för mikrotom bearbetning, som vanligtvis är skadlig för lysrör stainings. Alternativt kan Z-högar som görs i en konfokalmikroskop användas för att göra 3D-rekonstruktion av tvärsnitt bilder. Men det är tidskrävande att göra flera tunna Confocal skivor för en korrekt 3D-rekonstruktion och fotoblekning blir problematiskt. Ett annat bekymmer när imaging embryon som är monterade långskepps är den ljusspridning som uppstår när man kommer till djupare delar av embryot, vilket också komplicerar ta exakta mätningar av fluorescerande signaler i syfte att kvantifiering av protein eller mRNA-uttryck nivåer 1. Även med en två-photon konfokalmikroskop är ljusspridning fortfarande en oro på grund av opaciteten äggulan material i mitten av embryot, vilket gör valet av montering media för optimal insyn i prov som ska begränsas. För att kringgå dessa problem, vertikalt en ny teknik som kallas &quot;End-on&quot; avbildning av positionering embryon har nyligen utvecklats för att bilden både live och fasta prover 4. I detta papper har vi utvecklat ett nytt protokoll för vertikalt monterade embryon som möjliggör en enkel bearbetning och visualisering av fasta embryon eller vävnader av valfri storlek och form som är färgade med flera på plats sonder 3. Vår metod består av att använda ett montage medier med gelatinös konsistens som används för att innesluta anpassade embryon i den. Klipp block av denna montering media som innehåller inbäddade embryon kan placeras upprätt innan avbildning i någon typ av konfokalmikroskop. Genom att bädda in embryon till gelé och placera dem vertikalt, kan vi ta horisontella tvärsnitt med hjälp av konfokalmikroskopi, där cellerna längs ryggens-ventrala axeln på embryot presenteras samtidigt. Detta är en betydande förbättring för kvantifiering ändamål eftersom problem med ljusspridning och fotoblekning av fluorescerande färger som förekommer i konventionella Z-stack rekonstruktion av longitudinellt monterade embryon är nu eliminerats. Således är kvantifiering av genuttryck eller protein nivåer längs ryggens-ventrala axeln korrekt, eftersom cellerna ligger på motsatt dorsal-ventrala positioner avbildas på samma gång och på samma konfokala Z-position. Dessutom kan den beskrivna metoden för oss att skaffa en komplett 2-D bild över rygg-ventrala axel från en 3-D embryo utan att använda komplicerade beräkningsproblem dragits metoder för att visualisera celler vid olika positioner längs DV axel 6. Några av de kritiska stegen omfattar avlägsnande av glycerol efter justering embryon, för att undvika att dela mellan två lager av gelé. Om provet är för uttorkad, kommer den resulterande bilden vara missbildade och har felaktiga morfologi. Dessutom, om gelé mediet runt embryot är skuren i en vinkel istället för rakt, kan den resulterande bilden visas mindre rund och mer ovular i formen, på grund av en felaktig placering av embryona i en vinkel än 90 grader. Slutligen, om gelé inte kapas nära nog att embryot på främre / bakre ändar, är det inte möjligt att få en korrekt bild, eftersom målet är att arbeta avstånd skulle främst användas för att fokusera i gelé och inte embryot. Ett annat viktigt steg som kan behövas när imaging sent gastrulating embryot är att noggrant sortera stadierna av intresse omfattas innan anpassa dem. Vanligtvis är embryon iscensatt enligt morfologiska egenskaper som kan vara mest lätt att känna igen när en längsgående position. Bland alternativa modifieringar som kan göras med denna metod är att inkludera ett anti-fade reagens (t.ex. p-Fenylendiamin eller PPD) i det andra lagret gelé för att skydda mot fotoblekning av fluorescerande färgämnen.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycerin Jelly mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences Company</td>
<td>17998-10</td>
<td>Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss LSM 700 Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-544-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72204-02</td>
<td>Size 1 &frac12; (specific for the objectives used in this work).</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slips (for making supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherfinest</td>
<td>12-544-10</td>
<td>Use four coverslips glued with superglue. </td>
</tr>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td>
<td>M420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Steel back single edge industrial blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>21-401-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hypodermic needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>1482610</td>
<td>26 Gauge</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

upright imaging of drosophila embryos

Flera välkända morfogenetiska gradienter och cellulära rörelser uppstår längs ryggens / ventrala axel<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo. Men de nuvarande tekniker som används för att visa sådana processer är något begränsade. Följande protokoll beskriver en ny teknik för montering av fasta och märkta<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon för koronala visning med konfokal avbildning. Denna metod består i att bädda embryon mellan två lager av glycerin gelé montering media och bildhantering gelé remsorna placeras upprätt. Det första steget för sandwiching embryona är att göra en tunn bädd av glycerin gelé på en bild. Vidare är embryon noga anpassats på denna yta och täcks med ett andra lager av gelé. Efter andra lagret stelnat, är remsor av gelé klippa och vänt upprätt för avbildning. Alternativ beskrivs för visualisering av embryon beroende på vilken typ av mikroskop monter som ska användas. Eftersom alla celler längs ryggens-ventrala axeln är avbildad i en enda konfokala Z-planet, ger vår metod exakt mätning och jämförelse av fluorescerande signaler utan fotoblekning eller ljusspridning gemensamt för 3D-rekonstruktioner av longitudinellt monterade embryon.

Watch this Scientific Journal Video about Upright Imaging of Drosophila Embryos at JoVE.com

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Här presenterar vi ett montage protokoll för färgade<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon i upprätt läge som möjliggör avbildning av tvärsnitt med hjälp av konfokalmikroskopi.

Upprätt Imaging av Drosophila Embryon

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Beredning av Neuronal kulturer från Midgastrula Stage Drosophila embryon

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Beredningen av Drosophila Embryon för Live-Imaging Använda droppe protokollet

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Skörd och förbereda Drosophila Embryon för Elektrofysiologiska inspelning och andra förfaranden

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Beredning av embryon för elektronmikroskopi av Drosophila Embryonala hjärta tub

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Live dissekering av Drosophila Embryon: Effektivare metoder för screening Mutant Samlingar av Antibody färgning

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo Centrifugering av Drosophila embryon

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Primära cellkulturer från Drosophila Gastrula Embryon

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi Störningar av dsRNA Injektion i Drosophila Embryon

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Cell Shape Förändring Living Drosophila Embryon

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolering och rening av kinesin från Drosophila Embryon

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...