Name: assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging
Uploaded: 2010-10-02T17:00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging at JoVE.com

وأيد هذا البحث من خلال منحة من المعهد الوطني للصحة وجامعة تكساس في أرلينغتون إنشاء صناديق لMM.

1. زراعة النباتات والبكتيريا إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء هذا الإجراء زرع بذور Arabidopsis على ت 01:01:01 : V : V خليط من متوسط ​​النمو (ريدي الأرض وتخلط المكونات الشتلات ، أحد غرو) ، الفيرميكوليت غرامة ، والبيرلايت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو النباتات في غرفة النمو (22 درجة مئوية ، 12 ساعة من الضوء μmol / مم 2 / ثانية 100 يوميا و 65 ± 5 ٪ رطوبة) والماء حسب الحاجة. محطات جاهزة للاستخدام في 4-6 أسابيع عندما يكون لديهم أوراق الشباب توسعت بشكل كامل قبل انشقاقه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يومين من بدء التجربة تعد ثقافة بكتيريا. خط الزائفة syringae من المخزون الجلسرين على تعديل المتوسطة LB (10 جم / لتر تريبتون ، 5 ز / لتر خلاصة الخميرة ، 5 ز / لتر كلوريد الصوديوم الهيدروجيني 7.0 ، وأجار 1.5 ٪) ، واحتضان لمدة 24 ساعة عند 28 درجة مئوية. استخدام ثقافة جديدة لإعداد اللقاح والثقافة لوحات تبدأ دائما من المخزونات الجلسرين والبكتيريا يصبح أقل ضراوة بعد الفرعي زراعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البكتيريا التي تنمو على لوحة لبدء ثقافة 10 مل من السائل P. syringae في دورق مخروطي 50 مل. احتضان الثقافة بين عشية وضحاها حتى 28 درجة مئوية مع قوي يهز حتى تصل الكثافة البصرية أو OD في 600 نانومتر بين 0.8 و 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD في 600 وحصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 1360 x ج لمدة 10 دقائق. Resuspend الخلايا في الماء المقطر بحيث OD النهائي هو 0.2. OD هذا يتوافق مع 10 وحدات تشكيل مستعمرة 8 (CFU) / مليلتر. مع استعداد البكتيريا ، والمضي قدما لإعداد أوراق وأداء الفحص. </li></ol> 2. يلطخ الأوراق والحضانة مع البكتيريا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل إعداد أوراق صمة أول 20 ميكرومتر أو يوديد propidium PI حل في الماء. 10 مل من محلول يكفي لصبغ 3 يترك صغيرة في وقت واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد النباتات من النمو وغرفة مع ملقط فصل 3 الشباب يترك بالكامل الموسع. تزج يترك كله في حل بي لمدة 5 دقائق. ثم إزالة يترك لهم فترة وجيزة وشطف مع الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان التالي ورقة مع السطح السفلي لأسفل على شريحة المجهر. قطع ورقة بشفرة حلاقة حادة في أربعة قطع الوريد باستثناء منتصف بحيث يضع ورقة مسطحة على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحتضان هذه البكتيريا مع الأوراق ، وإضافة 300 ميكرولتر من تعليق الجرثومي تحت قطعة ورق على الشريحة. تأكد من أن السطح السفلي للورقة على اتصال مع اللقاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات تحت نفس الظروف البيئية التي كانت تستخدم لزراعة النباتات. في ذلك الوقت لمراقبة يترك تحت المجهر ، ونقل القطع ورقة لشريحة جديدة مع انخفاض سطح مواجهة. لاحظ أن لا يتم استخدام زلة تغطية عندما تصاعد الشرائح. ولا يمكن تصوير نموذج ورقة نفسه عدة مرات خلال الحضانة ، ويمكن تحديد مسار الزمن حتى وفقا لأهداف البحث. </li></ol> 3. المجهري والقياس وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا يستخدم ليزر المسح المجهر مبائر (LSM 510 ميتا ، وشركة كارل زايس) لفحص الأوراق. مراقبة السطح السفلي من الأوراق للكشف عن ومضان من PI (الإثارة 453 نانومتر ، وانبعاث 543 نانومتر 620). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام عينات من أوراق نفس التقاط الصور من الثغور على مر الزمن. حفظ الصور لقياس عرض الفتحة فوهي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس فوهي عرض فتحة لا يقل عن 60 الثغور لكل معاملة في كل نقطة زمنية باستخدام متصفح LSM الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب المتوسط ​​ومعيار الخطأ لعرض الفتحة فوهي. ويمكن حساب الدلالة الإحصائية للنتائج باستخدام 2 الذيل ، طالبة الحكمة المقترنة لاختبار t. </li></ol> 4. ممثل صور الاستجابة لفوهي الحضانة مع البكتيريا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا صورة نموذجية المجهرية (باستخدام هدفا 20X) من سطح الورقة Arabidopsis تحت مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر في مجال عرض مشرق (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البقع يوديد Propidium جدار الخلية من الخلايا قادرة على البقاء وزيادة وضوح من خلايا الحرس بالإضافة إلى السماح لتحديد الخلايا غير التالفة لجمع البيانات (الشكل 2). ويمكن رؤية مجموعة من فتحات المسام فوهي في هذه micrographs ، من الثغور مغلقة تماما لالثغور مفتوحة على مصراعيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحديد الثغور مغلقة تماما من شكل خلايا الحرس (الشكل 3). ويعتبر عرض الفتحة لتكون 0 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالثغور المفتوحة (الشكل 4) ويقاس عرض الفتحة أظهرت باستخدام خط مستقيم عبر رسمها على أوسع نطاق منطقة فوهي المسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذه هي النتائج التجريبية نموذجية من هذا الاختبار فوهي. Arabidopis يترك وحضنت في الظلام مع ثلاث سلالات مختلفة من syringae الزائفة. فقط للبكتيريا وكان توقيت المحيط الهادي DC3000 قادرا على فتح الثغور المغلقة المظلمة ، وتقاس على النحو الذي عرض فتحة الثغور 60 تم اختيارها عشوائيا في سلالة بكتيرية (الشكل 5). </li></oل&gt; <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. صورة مجهرية من السطح من نبات Arabidopsis. حقل واحد من عرض من سطح ورقة تحت المجهر متحد البؤر المسح بالليزر (LSCM) باستخدام الهدف 20X. علما بأن الفتحة فوهي ليس كما يتضح عند مقارنة عرض الفلورسنت بمساعدة من تلطيخ يوديد propidium (الشكل 2). <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. صورة مجهرية من سطح ورقة propidium Arabidopsis يوديد الملطخة. حقل واحد من عرض من سطح ورقة تحت المجهر متحد البؤر المسح بالليزر (LSCM) باستخدام الهدف 20X. لاحظ مجموعة من فتح المسام فوهي. وأشار إلى إغلاق الأسهم الصفراء تماما الثغور وأشار السهام الاخضر لالثغور مفتوحة على مصراعيها. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. تماما الثغور التي حددتها وثيقة على شكل وفتح بين الحرس الخلايا ويعتبر العرض لتكون الفتحة 0 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. الثغور المفتوحة يظهر عرض الفتحة في ميكرون. أخذت قياسات باستخدام متصفح LSCM على أساس خط مستقيم عبر رسمها على أوسع مساحة فوهي المسام. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. بقيت DC3118 ، DB29 ، وDC3000 النباتات في الظلام خلال فترة التجريب : الفتحة فوهي من أوراق Arabidopsis المحتضنة مع ثلاث سلالات البندورة الكهروضوئية syringae الزائفة... وتظهر النتائج على النحو يعني (ن = 50-70) ± الخطأ القياسي. تم الكشف عن دلالة إحصائية مع تجارب ر ثنائي الطرف الطالب. وتكررت التجربة ثلاث مرات مع نتائج مماثلة.

<ol>
	<li>Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+well-defined+series+of+coronatine+biosynthetic+mutants+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).</li><li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y., Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction.">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> The Arabidopsis Book. , (2002).</li><li>Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+DNA+region+required+for+production+of+the+phytotoxin+coronatine+by+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato.">Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126, 969-980 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

قدمنا ​​إجراء مستقيم إلى الأمام لقياس الفتحة فوهي في أنسجة نبات سليمة تسمح بتقييم سهولة استجابة فوهي للعلاجات المختلفة. على الرغم من أننا قد قدمت النتائج باستخدام نظام نموذجي Arabidopsis / syringae الزائفة ، يمكن فحص أوراق سليمة فوهي تنفيذ محتملة مع أي مزيج من النباتات بكتيريا. ويمكن بسهولة البروتوكول يمكن تعديلها لتناسب متطلبات نمو النباتات الأخرى ، ومسببات الأمراض البكتيرية. والمبدأ العام والإجراءات لا تزال هي نفسها. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الأسلوب قد تكون مفيدة للباحثين الذين يرغبون في الدراسة الفنية للانتاج خلايا الحرس ليس فقط للعيش الميكروبات ، ولكن أيضا لمنبهات أخرى ، والعوامل الكيميائية في ظل الظروف التي تحافظ على البيئة الطبيعية لنبات. يمكن نبات كله يكون من الصعب الصورة بسبب سماكة والتضاريس متفاوتة. ويمكن التخفيف من حدة هذه المشكلة عن طريق إزالة الوريد منتصف الورقة بحيث يضع مسطح على الشريحة وباستخدام المجهر مبائر. ومع ذلك ، يمكن استخدام أنواع أخرى من مضان المجهر للحصول على صور عالية الدقة لسطح الورقة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Propidium iodide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>P4864</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tryptone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP1421-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>0127-01-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>7647-14-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio Express</td>
<td>J637-2500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plant growth chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shaker incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser scanning confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging

الثغور هي الفتحات الطبيعية في البشرة النباتية المسؤولة عن تبادل الغازات بين النبات والبيئة الداخلية. تتشكل من قبل زوج من خلايا الحرس ، والتي هي قادرة على إغلاق المسام فوهي ردا على عدد من العوامل الخارجية بما في ذلك شدة الضوء ، تركيز ثاني أكسيد الكربون ، والرطوبة النسبية (RH). المسام فوهي هو أيضا الطريق الرئيسي لدخول العامل الممرض في الأوراق ، وخطوة حاسمة بالنسبة لتطور المرض. وقد كشفت الدراسات الحديثة أن إغلاق المسام فعال في الحد من تطور المرض الجرثومي في النباتات Arabidopsis ، جزءا لا يتجزأ من مناعة النبات الفطرية. سابقا ، وقد استخدمنا قشور البشرة لتقييم الاستجابة للعيش فوهي البكتيريا (Melotto وآخرون 2006) ؛ الحفاظ على الظروف البيئية غير المواتية لقشور النبات على حد سواء البشرة والخلايا البكتيرية قد التحدي. يمكن أن تبقى على قيد الحياة ورقة البشرة وصحية مع العازلة زارة التربية والعلم (10 ملي بوكل ، 25 مم ، MES كوه ، ودرجة الحموضة 6.15) للتجارب الكهربية للخلايا الحراسة. ومع ذلك ، هذا المخزن ليس من المناسب للحصول على تعليق البكتيرية. من ناحية أخرى ، يمكن أن تبقى على قيد الحياة في الخلايا البكتيرية الماء الذي ليس من المناسب للحفاظ على القشور البشرة لفترة طويلة من الوقت. عندما يطفو على الماء قشر البشرة ، والخلايا في القشرة التي تتعرض لجفاف الهواء في غضون 4 ساعات الحد من توقيت لإجراء التجربة. يجب على الأسلوب الأمثل لتقييم تأثير حافز خاص على خلايا الحرس الحاضر إلى الحد الأدنى من التدخل الفيزيولوجيا فوهي وعلى البيئة الطبيعية من النبات قدر الإمكان. نحن ، بالتالي ، وضعت طريقة جديدة لتقييم الاستجابة للعيش فوهي البكتيريا التي يتم تصغير كثيرا اصابة الأوراق والتلاعب التي تهدف إلى توفير مقايسة استنساخه بسهولة وموثوق بها فوهي. يستند هذا البروتوكول على تلوين أوراق سليمة مع يوديد propidium (PI) ، حضانة تلوين نبات مع تعليق البكتيرية ، والمراقبة من أوراق تحت مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر. أخيرا ، وهذا الأسلوب يسمح للمراقبة من العينة نبات يعيش نفسه على مدى فترات طويلة من الوقت باستخدام الظروف التي تحاكي بشكل وثيق في ظل الظروف الطبيعية التي تتعرض للهجوم من قبل النباتات مسببات الأمراض.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging at JoVE.com

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

قمنا بتطوير بروتوكول بسيطة وقابلة للتكرار للوصول إلى استجابة فوهي للبكتيريا حية. هذا الأسلوب يقلل من اصابة والتلاعب في أوراق بالمقارنة مع استخدام قشور البشرة ذكرت سابقا.

تقييم الاستجابة للعيش فوهي الخلايا البكتيرية باستخدام التصوير الجامعة ليف

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Luciferase به لالتهابات جرثومية في صورة الفئران

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

البكتيرية التصوير Bioluminescent<em&gt; في الجسم الحي</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

بكتيريا ورقة تسلل الفحص لتوصيف غرامة الردود الدفاع النبات باستخدام<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana-الزائفة syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

قياس الاستجابات الفسيولوجية لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الحسية إلى الدهن الفيرومونات عن طريق لايف التصوير الكالسيوم

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

التصوير المباشر لآخر مضاد من قبل العدلات الإنسان الأساسية وحيدات في الاستجابة لل<em&gt; A. فوميجاتوس</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

تقييم الاستجابة المناعية الخلوية ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، استخدام "في فيفو البلعمه بالانزيم"

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

التصوير ثلاثي الابعاد للخلايا البكتيرية للتمثيلات الخلوية الدقيقة وتعريب البروتين الدقيق

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...