Name: assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging
Uploaded: 2010-10-02T17:00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging at JoVE.com

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüsü ve The University of Texas at Arlington MM fonları tarafından hibe destek verdi.

1. Büyüyen Bitkiler ve hazırlanması Bakteriler <ol><li> V: v büyüyen orta karışımı (Redi-toprak fiş ve fide karışımı Sun, Gro), ince vermikülit, perlit, bu yordamı başlamak için 01:01:01 v Arabidopsis tohumları eker . </li><li> Bir büyüme odası (22 ° C, 12 saat 100 mmol / mm 2 / sn günlük ışık ve 65 ±% 5 nem) ve gerektiği kadar su bitkileri yetiştirin. Bitkiler 4-6 hafta içinde tamamen genişletilmiş genç yaprakları önce civatalama zaman kullanıma hazır. </li><li> Deney başlamadan önce iki gün bakteri kültürü hazırlar. LB, orta (10 g / L Tripton, 5 g / L maya özü, 5 g / L NaCl, pH 7.0 ve% 1.5 agar) değiştirilmiş ve 28 az 24 saat süreyle inkübe ° C gliserol stok Streak Pseudomonas syringae Inokulum hazırlamak ve bakteriler alt-kültür sonra daha az öldürücü olur gliserol stokları her zaman olduğu gibi kültür plakaları başlatmak için taze kültür kullanın. </li><li> Plaka üzerinde büyüdü bakteri P. 10 ml sıvı kültürü başlatmak için kullanın syringae 50 ml Erlenmeyer balonuna. Gecede kültür 28 ° C&#39;de 0.8 ile 1 arasında 600 nm dalga boyunda optik yoğunluk veya OD ulaşıncaya kadar kuvvetli sallayarak. </li><li> 600 OD ölçün ve 10 dakika 1360 xg&#39;de santrifüj hücrelerin hasat. Distile su ile son OD 0.2, böylece hücreleri tekrar Bu OD 10 8 koloni oluşturan birim (CFU) / mL karşılık gelir. Hazır bakteri, yaprakları hazırlamak ve analiz gerçekleştirmek için devam edin. </li></ol> 2. Bakteriler Yaprak Boyama ve Kuluçka <ol><li> Yaprakları ilk 20 mcM propidium iyodür veya suya PI çözüm hazırlamak leke için. 10 ml çözelti, bir seferde 3 küçük yaprak leke için yeterli. </li><li> 3 genç, tam genişletilmiş yaprak büyüme odasından ve forseps detach ile bitkiler al. 5 dakika PI çözüm tüm yaprakları bırakın. Sonra yaprakları kaldırmak ve onları saf su ile kısa bir süre yıkayın. </li><li> Sonraki yerde bir mikroskop lamı üzerine aşağı bakacak şekilde alt yüzeye sahip bir yaprak. Slayt yaprak düz bırakır, böylece orta damar içine keskin bir jilet hariç dört adet yaprak kesin. </li><li> Yaprakları ile bakteri inkübasyon için, slayt yaprak parçaları altında bakteriyel süspansiyon 300 mcL ekleyin. Yaprağın alt yüzeyi inokulum ile temas halinde olduğundan emin olun. </li><li> Bitkilerin büyümesi için kullanılan aynı çevre koşullarında örnekleri inkübe edin. Mikroskop altında yaprakları gözlemlemek zamanda yaprak parçaları, alt yüzeyi yukarı bakacak şekilde yeni bir slayt aktarın. Slaytlar montaj kapağı kayma olmadığını unutmayın. Aynı yaprak örneği inkübasyon sırasında birden çok kez görüntülenmiş olabilir ve bir süre ders, araştırma hedeflerine göre ayarlanmış olabilir. </li></ol> 3. Mikroskopi, Ölçme ve Veri Analizi <ol><li> Burada konfokal mikroskop bir lazer tarama (EKK 510 Meta, Carl Zeiss Inc.) Yaprakları incelemek için kullanılır. PI (eksitasyon 453 nm, emisyon 543 ve 620 nm) floresan algılamak için yaprakların alt yüzeyi dikkat edin. </li><li> Aynı yaprak örnekleri kullanarak zamanla stoma görüntüleri yakalayabilir. Stoma diyafram genişliğini ölçmek için kaydedin. </li><li> LSM görüntü tarayıcısı kullanarak her zaman bir noktada her bir tedavi için en az 60 stoma stoma diyafram genişliği ölçün. </li><li> Stoma diyafram genişliği için ortalama ve standart hata hesaplayın. Sonuçlarının istatistiksel anlamlılık 2 kuyruklu bilge Öğrenci, eşleştirilmiş t-testi kullanılarak hesaplandı. </li></ol> 4. Bakteriler Kuluçka Stoma Tepki Temsilcisi Görüntüler <ol><li> İşte, parlak bir alan görünümü (Şekil 1) konfokal mikroskop lazer tarama altında bir Arabidopsis yaprak yüzeyi tipik bir mikroskobik görüntü (20x amacı kullanarak) . </li><li> Propidium iyodür lekeleri veri toplama (Şekil 2) hasarsız hücrelerinin tanımlanması için izin vermeye ek olarak bekçi hücreleri görünürlüğünü artırarak canlı hücreleri hücre duvarı. Stoma gözenek açıklıkları bir dizi, tamamen kapalı stoma geniş açık stoma, bu mikrograflar görülebilir. </li><li> Tamamı kapalı stoma bekçi hücrelerin şekil (Şekil 3) tarafından tespit edilir. Diyafram genişliği 0 mm olarak kabul edilir. </li><li> Açık stoma (Şekil 4) için gösterilen diyafram genişliği stoma gözenek geniş alan boyunca çizilen düz bir çizgi ile ölçülür. </li><li> Bunlar bu stoma testin tipik deneysel sonuçlar Arabidopis yaprakları Pseudomonas syringae üç farklı suşları ile karanlıkta inkübe edildi. Sadece bakteri Pst DC3000 koyu-kapalı stoma, bakteri suşunun başına rastgele seçilen 60 stoma (Şekil 5) diyafram genişliği ile ölçülen açmak mümkün. </li></ol&gt; <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Arabidopsis bir yaprak yüzeyi Mikrografik konfokal mikroskobu (LSCM) 20x objektif kullanarak lazer tarama altında yaprak yüzeyi görüş alanı. Propidium iyodür boyama (Şekil 2) yardımıyla floresan görünümüne göre stoma diyafram gibi belirgin olmadığını unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Propidium iyodür lekeli Arabidopsis yaprak yüzeyi Mikrografik konfokal mikroskobu (LSCM) 20x objektif kullanarak lazer tarama altında yaprak yüzeyi görüş alanı. Stoma gözenek açılması bir dizi dikkat edin. Sarı oklar stoma tamamen kapatmak için işaret ve yeşil okları geniş açık stoma işaret edilir. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Tamamen şekil ve bekçi hücreleri arasındaki açıklık tespit yakın stoma diyafram genişliği 0 mm olarak kabul edilir. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Mikron diyafram genişliği gösteren Açık stoma. Ölçümler stoma gözenek geniş alan boyunca çizilen düz bir çizgi dayalı LSCM tarayıcı kullanarak alındı. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5. Arabidopsis yaprakları üç Pseudomonas syringae pv domates suşları ile inkübe Stoma diyafram: DC3118, DB29 ve DC3000 Tesisleri deneme süresi boyunca karanlıkta tutulmuştur. Sonuçlar ortalama olarak verilmiştir (n = 50-70) ± standart hata. Iki kuyruklu Student t-testi ile istatistiksel anlamlılık tespit edildi. Deney benzer sonuçlar veren üç kez tekrarlandı.

<ol>
	<li>Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+well-defined+series+of+coronatine+biosynthetic+mutants+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000.">Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).</li><li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y., Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction.">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> The Arabidopsis Book. , (2002).</li><li>Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+DNA+region+required+for+production+of+the+phytotoxin+coronatine+by+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato.">Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126, 969-980 (2006).</li></ol>

Biz, farklı tedavilere stoma yanıt kolay bir değerlendirme için izin sağlam yaprak dokusunda stoma diyafram ölçmek için bir yalındır prosedürü sundu. Model sistem Arabidopsis / Pseudomonas syringae kullanarak sonuçlarını sundu olmasına rağmen, bozulmamış yaprak stoma tahlil potansiyel olarak herhangi bir bitki-bakteri kombinasyonu ile yapılabilir . Protokolü, diğer bitkiler ve bakteriyel patojenler büyüme gereksinimlerini kolayca sığacak şekilde modifiye edilebilir. Genel ilke ve prosedür aynı kalır. Buna ek olarak, bu yöntem mikroplar yaşamak için bekçi hücreleri sadece fonksiyonel çıktı okumak isteyen araştırmacılar için yararlı olabilir, ama aynı zamanda, yaprak doğal ortamını korumak koşullar altında diğer uyaranların ve kimyasal ajanlar olabilir. Tüm yaprak kalınlığı ve engebeli topografyası nedeniyle görüntü için zor olabilir. Bu sorun, yaprak orta damar düz durduğundan slayt kaldırma ve konfokal mikroskopi kullanılarak kontrol altına alınabilir. Ancak, diğer tip floresan mikroskop yaprak yüzeyinin yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için kullanılabilir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Propidium iodide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>P4864</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tryptone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP1421-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>0127-01-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>7647-14-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio Express</td>
<td>J637-2500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plant growth chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shaker incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser scanning confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging

Stoma bitki iç ve çevre arasındaki gaz değişimi için sorumlu olan bitki epidermisin doğal açıklıklar. Bu ışık yoğunluğu, karbon dioksit konsantrasyonu, ve bağıl nem (RH) de dahil olmak üzere bir dizi dış etkenlere yanıt olarak stoma gözenek kapatmak için bekçi hücreleri, bir çifti tarafından oluşturulur. Stoma gözenek da ana güzergah yaprakların içine patojen giriş, hastalık gelişimi için önemli bir adım. Son çalışmalar, gözenek kapatılması Arabidopsis bitkilerin bakteriyel hastalık gelişimi en aza indirilmesinde etkili olduğunu açıkladı; bitki doğal bağışıklık ayrılmaz bir parçasıdır . Önceden, canlı bakteriler (Melotto et al 2006), stoma tepki değerlendirmek için epidermal peeling; ancak bitki epidermal peeling ve bakteri hücreleri için olumlu çevre koşulları muhafaza zorlu olmuştur . Yaprak epidermisin bekçi hücreleri elektrofizyolojik deneyler için MES tamponu (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) ile canlı ve sağlıklı olarak muhafaza edilebilir. Ancak, bu tampon bakteri süspansiyonu elde etmek için uygun değildir. Öte yandan, bakteri hücrelerinin epidermal peeling kez uzun süre korumak için uygun değildir su canlı tutulabilir. 4 saat içinde hava kuru maruz kalan kabuğu, su üzerinde epidermal kabuğu yüzer, hücreleri deney yapmak için zamanlama sınırlayıcı. Bekçi hücreleri belirli bir uyaranın etkisini değerlendirmek için ideal bir yöntem stoma fizyolojisi ve tesisi mümkün olduğunca doğal çevreye minimal girişim sunmalıdır. Bu nedenle, yaprak yaralama ve manipülasyon kolayca tekrarlanabilir ve güvenilir bir stoma tahlil sağlamayı amaçlayan önemli ölçüde minimize edildiği bakterilerin yaşaması için stoma yanıtı değerlendirmek için yeni bir yöntem geliştirdi. Protokol propidium iyodür (PI), bakteri süspansiyonu ile yaprak boyama inkübasyon, lazer tarama konfokal mikroskop altında yaprakları gözlem ve sağlam yaprak boyama dayanmaktadır. Son olarak, bu yöntem bitkiler patojenler tarafından saldırıya altında doğal koşulları yakından taklit koşulları kullanarak uzun süre boyunca aynı canlı yaprak örnek gözlem için izin verir.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging at JoVE.com

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Biz canlı bakteri stoma yanıt erişmek için basit ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirmiştir. Bu yöntem daha önce bildirdiği epidermal peeling kullanımı ile karşılaştırıldığında yaprak yaralama ve manipülasyona en aza indirir.

Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm<em&gt; Drosophila</em&gt; Canlı Kalsiyum Görüntüleme kullanma Lipit Feromonlar Sensory Nöronlar

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Cevabı İnsan İlköğretim nötrofiller ve monositler tarafından Antifungal Faaliyet Canlı Görüntüleme<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

Doğru Hücresel Temsiller ve Hassas Protein Lokalizasyonu için Bakteri Hücrelerinin Üç Boyutlu Görüntülemesi

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...