Name: mutagenesis and functional analysis of ion channels heterologously expressed in mammalian cells
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells at JoVE.com

وأدلى عملنا بفضل الدعم المالي من صندوق الهبات ماكنايت علم الأعصاب (PAS) ، والمعهد الوطني لتعاطي المخدرات (R01 DA019022 ؛ PAS) ، وقبل المعاهد الوطنية للصحة NRSA الدكتوراه زمالة للسلطة الفلسطينية (F31AA017042) من المعهد الوطني لتعاطي الكحول والإدمان على الكحول. وزودت متحولة GIRK2 - L257W الدكتور أريال Prafulla. مضان المجهر ورعايته قدمت تفضلت آلات لايكا.

<ol>
	<li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation.">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li><li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K++channels+examined+by+scanning+mutagenesis.">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li><li>Doyle, D. A., Cabral, M. o. r. a. i. s., Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp;amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+potassium+channel:+molecular+basis+of+K++conduction+and+selectivity.">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li><li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera.">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li><li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K++channel+Kir2.2+at+3.1+&amp;Aring;+resolution.">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &amp;Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

موقع الموجه الطفرات هو النهج الكلاسيكي لدراسة بنية وظيفة علاقات القنوات الأيونية. لأنه يقوم على فرضية أن طريق تغيير بقايا تنتقد القناة الايونية ينبغي للمرء أن يكون قادرا على مراقبة التغيرات وضوحا في وظيفة القناة. في المقابل ، يمكن عرض العديد من الطفرات في موقف غير الحرجة دون حدوث اضطرابات كبيرة في وظيفة القناة. عادة ، يتم تحور لأول مرة في المسألة إلى بقايا ألانين ، صغيرة غير القطبية الأحماض الأمينية ، تليها لطفرة التربتوفان ، وهو أكبر من الأحماض الأمينية 2. إذا كانت بقايا المهم وظيفة القناة ، سوف تغير كل من الطفرات نشاط القناة. إذا تحولت بقايا أقل أهمية ، وآثار الطفرة ، وبخاصة للألانين وغالبا ما تكون غير ملحوظة. الطفرات التربتوفان هي أكثر احتمالا للتسبب تغيرات بسبب العراقيل المرتبطة الفراغية حجم التربتوفان. في كثير من الأحيان ، يمكن استخدام هذه المعلومات عندما تفتقد الهيكلية ، طفرة منهجية لألانين أو التريبتوفان في غضون جزء من قناة (تسمى ألانين أو المسح التربتوفان) لتحديد موقع بقايا حرجة. ومن المهم أن نلاحظ أن الحيوانات المستنسخة يمكن إعداد متعددة مع الطفرات نقطة مختلفة في السماح موازية لاختبار مخلفات متعددة ضمن فترة زمنية قصيرة نسبيا. في الآونة الأخيرة ، أصبحت هياكل الكريستال متعددة من القنوات المتاحة 3،4،5. يمكن استخدامها لاقتراح مخلفات الرئيسية المحتملة لفحصها باستخدام النهج الموصوفة في هذا البروتوكول. وينبغي على قياسات البرية من نوع القناة ترافق دائما قياس قناة متحولة لتكون بمثابة مراقبة إيجابية للتأكد من أن أجريت تجارب ترنسفكأيشن والكهربية بشكل صحيح. الطفرات قد يؤدي إلى نقطة عدم وجود الوظيفية الحالية ، وهي مشابهة للائحة الحالية من النوع البري أو تغيير نشاط القناة. قد تفتقر الحالية قابلة للقياس يكون نتيجة لسوء الاتجار لطي أو تغييرها. في مثل هذه الحالة قد يكون من المفيد معرفة ما إذا كانت القناة يتاجر بشكل صحيح على السطح باستخدام مقايسة biotinylation أو تلطيخ المناعي ضد العلامة خارج الخلية (بدون permeabilization الخلية) للتمييز بين القنوات غير وظيفية في غشاء البلازما وقنوات الاحتفاظ داخل الخلية . وأخيرا ، فإنه من المستحسن أن التحقيق ليس فقط النشاط القاعدي للقناة ولكن أيضا من عواقب الطفرات بشأن تنظيم القناة. ويمكن دراسة آليات مختلفة للتعديل وظيفة قناة تبعا للقناة أيون ذات الاهتمام بما في ذلك تنظيم مجموعة من البروتينات ، PIP2 ، الأيونات ATP التركيز ، والفسفرة (باستخدام التيروزين ، أو السيرين ثريونين الطفرة) ، أو ubiquitination sumoylation (باستخدام الطفرة يسين) وفتاحات أو حاصرات قناة مباشرة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"> 
 
 <div>
 <table border="1">
 <thead>
 <tr>
 <td>Material Name</td>
 <td>Type</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 </thead>
 <tbody>
 
<tr>
<td>Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Varies</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Radiacwash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biodex</td>
<td>005-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>CB40210</td>
<td>Poly-L-lysine can also be used</td>
</tr>
<tr>
<td>Maxi Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>200512-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips &#x02C6;&#x2026; 12 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>CS-12R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>G150-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank">Inverted fluorescence microscope</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMI3000 B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrophysiology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon/ Leica/ Zeiss</td>
<td>Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axon Axopatch 200B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>VC-6 Perfusion MM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1320 digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Manipulator: MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>PC10 vertical electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isolation Table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
<td>Air table</td>
<td>&nbsp;</td> </tbody>
 </table>
 </div>

mutagenesis and functional analysis of ion channels heterologously expressed in mammalian cells

سوف نقوم شرح كيفية دراسة الآثار الفنية لإدخال طفرة نقطة في قناة أيون. ندرس بروتين G - بوابات البوتاسيوم داخليا تصحيح (المشار إليها باسم GIRK) القنوات ، والتي تعتبر هامة لتنظيم استثارة الخلايا العصبية. هناك أربعة أنواع مختلفة من الثدييات قناة GIRK مفارز (GIRK1 - GIRK4) -- ونحن نركز على GIRK2 لأنه يشكل homotetramer. التحفيز من أنواع مختلفة من مستقبلات البروتين يقترن G (GPCRs) ، مثل مستقبلات المسكارينية (M2R) ، ويؤدي الى تفعيل قنوات GIRK. الكحول أيضا تنشيط قنوات مباشرة GIRK. وسوف نبين كيفية تحور one الأحماض الأمينية عن طريق تغيير واحد أو أكثر تحديدا النيوكليوتيدات في [كدنا] للقناة GIRK. سوف تتضخم تحور هذا التسلسل [كدنا] في البكتيريا ، وتنقيته ، وسوف يتم تأكيد وجود طفرة النقطة تسلسل الحمض النووي. وسيتم في transfected cDNAs للقنوات GIRK تحور والبرية من نوع الخلايا الجنينية البشرية في الكلى HEK293T تربيتها في المختبر. أخيرا ، سيتم استخدام خلية كاملة التصحيح ، المشبك الكهربية لدراسة التيارات العيانية البوتاسيوم من خلال القنوات وأعرب ectopically GIRK من النوع البري أو تحور. في هذه التجربة ، وسوف ندرس تأثير طفرة في L257W GIRK2 على تفعيل قنوات M2R والتي تعتمد على الكحول.

Watch this Scientific Journal Video about Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells at JoVE.com

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

سوف نقوم شرح كيفية دراسة تأثير طفرة نقطة واحدة على وظيفة قناة أيون.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

نبض مطاردة تحليل سلاسل السكر N - الموصولة من جليكوبروتينات في خلايا الثدييات

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

تحليل مزدوج الجديلة إصلاح الحمض النووي (DSB) فاصل في خلايا الثدييات

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

بروتوكولات اختيار الطفرات وظيفية لتطور المخرج من البروتينات في E. القولونية</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

توصيف وظيفي نا<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; المبادلات بين الخلايا من المقصورات عن طريق بروتون-مما أسفر عن مقتل اختيار للتعبير عنها في غشاء البلازما

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...