Name: mutagenesis and functional analysis of ion channels heterologously expressed in mammalian cells
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00
Duration: 15 min 28 s
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और एक पूर्व डॉक्टरेट NIH एनआरएसए पीए फेलोशिप (F31AA017042) शराब सेवन पर राष्ट्रीय संस्थान से, हमारा काम न्यूरोसाइंस (पीए), नशीली दवाओं के सेवन पर राष्ट्रीय संस्थान (पीए R01 DA019022) के लिए McKnight बंदोबस्ती कोष से वित्तीय सहायता के द्वारा संभव बनाया गया था और शराब. उत्परिवर्ती GIRK2-L257W डॉ. प्रफुल्ल Aryal द्वारा प्रदान की गई थी. प्रतिदीप्ति खुर्दबीन और प्रायोजन कृपया Leica उपकरण द्वारा प्रदान की गई है.

<ol>
	<li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation.">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li><li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K++channels+examined+by+scanning+mutagenesis.">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li><li>Doyle, D. A., Cabral, M. o. r. a. i. s., Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp;amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+potassium+channel:+molecular+basis+of+K++conduction+and+selectivity.">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li><li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera.">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li><li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K++channel+Kir2.2+at+3.1+&amp;Aring;+resolution.">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &amp;Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

साइट - निर्देशित mutagenesis आयन चैनलों की संरचना समारोह रिश्तों का अध्ययन करने के लिए एक शास्त्रीय दृष्टिकोण है. यह आधार है कि आयन चैनल के एक महत्वपूर्ण अवशेषों बदलकर एक चैनल के समारोह में स्पष्ट परिवर्तन देखने में सक्षम होना चाहिए पर आधारित है. इसके विपरीत, गैर गंभीर स्थिति में कई परिवर्तन चैनल के समारोह के लिए प्रमुख perturbations के बिना शुरू किया जा सकता है है. आमतौर पर, पहले प्रश्न में अवशेषों alanine, एक छोटे गैर ध्रुवीय एमिनो एसिड tryptophan, एमिनो एसिड की सबसे बड़ी 2 उत्परिवर्तन के बाद mutated है . यदि अवशेषों चैनल के समारोह के लिए महत्वपूर्ण है, दोनों म्यूटेशनों चैनल गतिविधि बदल जाएगा. यदि एक कम आवश्यक अवशेषों mutated है, उत्परिवर्तन, विशेष रूप से alanine के प्रभाव अक्सर unremarkable. Tryptophan म्यूटेशनों अधिक tryptophan के आकार के साथ जुड़े steric बाधा के कारण परिवर्तन के कारण होने की संभावना हैं. अक्सर, जब संरचनात्मक जानकारी की कमी है, चैनल (alanine या tryptophan स्कैन कहा जाता है) का एक टुकड़ा के भीतर alanine या tryptophan करने के लिए व्यवस्थित उत्परिवर्तन महत्वपूर्ण अवशेषों का पता लगाने में इस्तेमाल किया जा सकता है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि अलग बिंदु उत्परिवर्तन के साथ कई क्लोनों समानांतर अपेक्षाकृत कम समय के भीतर एकाधिक अवशेष परीक्षण के लिए अनुमति में तैयार किया जा सकता है. हाल ही में, कई चैनलों के क्रिस्टल संरचनाओं उपलब्ध हो गए हैं 3,4,5. वे संभावित प्रमुख करने के लिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर परीक्षण किया अवशेषों का प्रस्ताव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जंगली प्रकार के चैनल पर माप हमेशा एक उत्परिवर्ती चैनल को विश्वास दिलाता हूं कि अभिकर्मक और electrophysiological प्रयोगों सही ढंग से किया गया एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा की माप के साथ करना चाहिए. प्वाइंट म्यूटेशनों एक कार्यात्मक वर्तमान की कमी, एक मौजूदा चैनल गतिविधि के जंगली प्रकार या बदल विनियमन के लिए इसी तरह करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. औसत दर्जे का वर्तमान के अभाव अनुचित तह या बदल तस्करी की वजह से हो सकता है. ऐसी स्थिति में यह उपयोगी हो सकता है पता लगाने के लिए कि क्या चैनल biotinylation परख या बाह्य टैग खिलाफ immunofluorescence धुंधला (सेल permeabilization बिना) के प्लाज्मा झिल्ली और सेल के अंदर बनाए रखा चैनलों पर गैर कार्यात्मक चैनलों के बीच भेद का उपयोग कर सतह के लिए सही ढंग से traffics है . अंत में, यह न केवल लेकिन यह भी चैनल चैनल विनियमन पर उत्परिवर्तन के परिणाम के बेसल गतिविधि की जांच उचित है. चैनल समारोह के मॉडुलन के विभिन्न तंत्र जी प्रोटीन, PIP2, आयनों, एटीपी एकाग्रता, phosphorylation (tyrosine, सेरीन या threonine उत्परिवर्तन का उपयोग करके), ubiquitination या sumoylation (lysine उत्परिवर्तन का उपयोग करके) द्वारा विनियमन सहित हित के आयन चैनल के आधार पर अध्ययन किया जा सकता और प्रत्यक्ष चैनल सलामी बल्लेबाज या ब्लॉकर्स.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"> 
 
 <div>
 <table border="1">
 <thead>
 <tr>
 <td>Material Name</td>
 <td>Type</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 </thead>
 <tbody>
 
<tr>
<td>Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Varies</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Radiacwash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biodex</td>
<td>005-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>CB40210</td>
<td>Poly-L-lysine can also be used</td>
</tr>
<tr>
<td>Maxi Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>200512-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips &#x02C6;&#x2026; 12 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>CS-12R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>G150-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank">Inverted fluorescence microscope</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMI3000 B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrophysiology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon/ Leica/ Zeiss</td>
<td>Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axon Axopatch 200B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>VC-6 Perfusion MM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1320 digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Manipulator: MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>PC10 vertical electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isolation Table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
<td>Air table</td>
<td>&nbsp;</td> </tbody>
 </table>
 </div>

mutagenesis and functional analysis of ion channels heterologously expressed in mammalian cells

हम कैसे एक आयन चैनल में एक बिंदु उत्परिवर्तन शुरू करने की कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रदर्शन करेंगे. हम जी प्रोटीन-gated भीतर सुधार (GIRK के रूप में संदर्भित) पोटेशियम चैनलों, जो न्यूरॉन्स के excitability के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं अध्ययन. वहाँ चार अलग अलग स्तनधारी GIRK चैनल सब यूनिटों (GIRK1 GIRK4) कर रहे हैं - हम GIRK2 पर ध्यान केंद्रित है क्योंकि यह एक homotetramer रूपों. जी प्रोटीन युग्मित (GPCRs) जैसे muscarinic रिसेप्टर (M2R), रिसेप्टर्स, के विभिन्न प्रकार की उत्तेजना GIRK चैनलों के सक्रियण के लिए होता है. शराब भी सीधे GIRK चैनल सक्रिय. हम दिखा देंगे कि कैसे सीडीएनए में GIRK चैनल के लिए विशेष रूप से एक या एक से अधिक nucleotides बदलने के द्वारा एक एमिनो एसिड रूप बदलना करने के लिए. यह उत्परिवर्तित सीडीएनए अनुक्रम बैक्टीरिया में परिलक्षित हो जाएगा, शुद्ध, और बिंदु उत्परिवर्तन की उपस्थिति डीएनए अनुक्रमण द्वारा की पुष्टि की जाएगी. उत्परिवर्तित और जंगली प्रकार GIRK चैनलों के लिए cDNAs मानव भ्रूण गुर्दे HEK293T इन विट्रो में संवर्धित कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया जाएगा. अंत में, पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी ectopically व्यक्त जंगली प्रकार या उत्परिवर्तित GIRK चैनलों के माध्यम से macroscopic पोटेशियम धाराओं का अध्ययन किया जाएगा. इस प्रयोग में, हम M2R निर्भर है और शराब पर निर्भर सक्रियण पर GIRK2 चैनल में एक L257W उत्परिवर्तन के प्रभाव की जांच करेंगे.

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Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

हम कैसे एक आयन चैनल के समारोह पर एक एकल बिंदु उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रदर्शन करेंगे.

Mutagenesis और आयन चैनल के कार्यात्मक विश्लेषण Heterologously स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Xenopus oocytes में व्यक्त आयन चैनल के पैच दबाना रिकॉर्डिंग

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

स्तनधारी कक्ष में glycoproteins से पल्स पीछा एन जुड़े चीनी चेन का विश्लेषण

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

पैच और आयन चैनल के अध्ययन के लिए दबाना छिड़काव तकनीक में व्यक्त Xenopus Oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

अभिव्यक्ति और HEK-293T कक्ष में पुनः संयोजक वोल्टेज gated आयन चैनल के electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित अभिकर्मक रणनीति

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

MRNA परमाणु निर्यात कैनेटीक्स के Microinjection द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में विश्लेषण

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis और कार्यात्मक निर्देशित प्रोटीन में एवोल्यूशन के लिए चयन प्रोटोकॉल ई. कोलाई</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

सेल चक्र स्थिति के स्तनधारी कोशिकाओं में विश्लेषण

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

अलगाव और संवर्धित कोशिकाओं और माउस के ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया के कार्यात्मक विश्लेषण

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

ना के कार्यात्मक विशेषता<sup&gt; +</sup&gt; / एच<sup&gt; +</sup&gt; चुनाव में प्रोटोन-हत्या का प्रयोग intracellular डिब्बों की एक्सचेंजर्स प्लाज्मा झिल्ली में उन्हें व्यक्त करने के लिए

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...