Name: mutagenesis and functional analysis of ion channels heterologously expressed in mammalian cells
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00
Duration: 15 min 28 s
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アルコール乱用の国民の協会からとPAのプリ博士NIH NRSAフェローシップ（F31AA017042）、私たちの活動は、神経科学（PAS）、国立薬物乱用研究所（PAS R01 DA019022）のためのマックナイト基金基金からの財政支援によって可能となったとアルコール依存症。 GIRK2 - L257W変異体は、博士プラフルラAryalによって提供されていました。 親切にライカインスツルメンツが提供する蛍光顕微鏡とスポンサーシップ。

<ol>
	<li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation.">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li><li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K++channels+examined+by+scanning+mutagenesis.">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li><li>Doyle, D. A., Cabral, M. o. r. a. i. s., Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp;amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+potassium+channel:+molecular+basis+of+K++conduction+and+selectivity.">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li><li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera.">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li><li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K++channel+Kir2.2+at+3.1+&amp;Aring;+resolution.">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &amp;Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

部位特異的突然変異誘発法は、イオンチャネルの構造と機能の関係を研究する古典的なアプローチです。それはイオンチャネルの重要な残基を変更することにより、一つのチャネルの機能に顕著な変化を観察することができるはずという前提に基づいています。対照的に、非クリティカルな位置に多くの変異は、チャネルの機能に大きな摂動なしで導入することができる。通常は、問題の残留物が最初にアラニン、トリプトファン、アミノ酸の最大の2〜突然変異が続く小さな非極性アミノ酸に変異している。残留物は、チャネルの機能に重要な場合は、両方の変異がチャネル活性を変更します。あまり本質的な残基が変異している場合、特にアラニンへの変異の影響は、しばしば平凡です。トリプトファンの変異は、トリプトファンのサイズに関連付けられている立体的な支障に起因する変化を引き起こす可能性が高くなります。多くの場合、チャンネル（アラニンやトリプトファンスキャンと呼ばれる）の断片の中アラニンやトリプトファンの構造情報が不足して、体系的な変異が重要な残基を特定するために使用することができます。別の点突然変異を持つ複数のクローンを並列比較的短い時間内に複数の残基をテストするためにできるように製造することができることに注意することは重要です。最近では、チャネルの複数の結晶構造は3,4,5利用できるようになりました。彼らは、このプロトコルで説明されているアプローチを使用してテストすることがキーとなる可能性がある残基を提案するために使用することができます。 野生型チャネル上の測定値は常にトランスフェクションし、電気生理学的実験が正しく行われたことを確実にするためのポジティブコントロールとして機能する変異体チャネルの測定を添付してください。点突然変異は、機能的な現在の不足にチャネル活性の野生型または改変された規制と同様の電流を導くことができる。測定可能な電流の欠如は、不適切な折りたたみまたは変更された人身売買に起因する可能性があります。このようなケースでは、チャネルがセルの内部留保の非機能的な細胞膜上のチャンネルとチャンネルを区別するために細胞外タグに対するビオチン化アッセイまたは免疫蛍光染色を（細胞浸透性のない）を使用して表面に正確にトラヒックのかどうかを確認すると便利な場合があります。最後に、チャネルだけでなく、チャネルの規制上の変異の影響の基底活性だけでなく、を調査することをお勧めします。チャネル機能の調節機序の異なるが、Gタンパク質、PIP2、イオン、ATP濃度、リン酸化（チロシン、セリンまたはスレオニンの変異を使用して）、ユビキチン化やSUMO化（リジンの突然変異を使用して）による規制を含む、対象のイオンチャネルの種類により研究される可能性とダイレクトチャネルオープナーまたはブロッカー。

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 <div>
 <table border="1">
 <thead>
 <tr>
 <td>Material Name</td>
 <td>Type</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 </thead>
 <tbody>
 
<tr>
<td>Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Varies</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Radiacwash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biodex</td>
<td>005-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>CB40210</td>
<td>Poly-L-lysine can also be used</td>
</tr>
<tr>
<td>Maxi Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>200512-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips &#x02C6;&#x2026; 12 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>CS-12R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>G150-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank">Inverted fluorescence microscope</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMI3000 B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrophysiology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon/ Leica/ Zeiss</td>
<td>Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axon Axopatch 200B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>VC-6 Perfusion MM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1320 digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Manipulator: MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>PC10 vertical electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isolation Table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
<td>Air table</td>
<td>&nbsp;</td> </tbody>
 </table>
 </div>

mutagenesis and functional analysis of ion channels heterologously expressed in mammalian cells

我々は、イオンチャネルの点突然変異を導入することの機能的効果を研究する方法を説明します。我々は、ニューロンの興奮性を調節するための重要なGタンパク質依存性内向き整流カリウム（GIRKと呼ばれる）チャンネルを、研究しています。つの異なる哺乳類のGIRKチャネルのサブユニット（GIRK1 - GIRK4）があります - それはホモ四量体を形成するので、我々はGIRK2に焦点を当てる。このようなムスカリン性受容体（M2R）のようなGタンパク質共役受容体（GPCR）、、のさまざまな種類の刺激は、GIRKチャネルの活性化につながる。アルコールはまた、直接GIRKチャネルをアクティブにします。我々は、特にGIRKチャネルのcDNAで1つ以上のヌクレオチドを​​変更することにより、一つのアミノ酸を変異させる方法を紹介します。この変異cDNA配列は、精製された、細菌中で増幅され、点突然変異の存在はDNAシークエンシングによって確認されます。変異と野生型GIRKチャネルのcDNAは、in vitroで培養したヒト胚性腎HEK293T細胞にトランスフェクトされます。最後に、ホールセルパッチクランプ電気生理学は、異所性に発現した野生型または変異GIRKチャネルを介して巨視的なカリウム電流を研究するために使用されます。この実験では、M2R依存とアルコール依存性活性化に関するGIRK2チャンネルでL257Wの突然変異の効果を検討する。

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Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

我々は、イオンチャンネルの機能上の単一の点変異の効果を研究する方法を説明します。

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

哺乳動物細胞での糖タンパク質からN -結合型糖鎖のパルス - チェイス分析

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

内タンパク質の定方向進化のための変異導入と機能選択プロトコル E.大腸菌</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

ナの機能的特徴<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup細胞膜でそれらを表現するためにプロトン殺す選択を使用した細胞内区画の&gt;交換器

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...