Name: colony forming cell (cfc) assay for human hematopoietic cells
Uploaded: 2010-12-18T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells at JoVE.com

Damos las gracias al Alvin J. Siteman Cancer Center en la Universidad de Washington Escuela de Medicina y Barnes-Jewish Hospital en St. Louis, MO, por el uso del Núcleo clasificador de alta velocidad de la célula, que proporcionó el equipo de citometría de flujo y los servicios de clasificación. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01 HL082549 HL084179 y K02 (NRY). El Siteman Cancer Center es apoyado en parte por un apoyo del NCI Cancer Center de Grant P30 CA91842.

1. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS <ol><li> Preparar soluciones estériles acciones 1000x de Fms relacionados con la tirosina quinasa 3 (FLT-3) ligando, de granulocitos / macrófagos factor estimulante de colonias (GM-CSF), factor de células madre (SCF), trombopoyetina (TPO), la interleuquina (IL) -3 , y la IL-6 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Prepare una solución estéril de acciones Retronectin (1mg/ml), también de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Divide estas soluciones madre en pequeñ...

<ol>
	<li>Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9+induces+long-term+proliferation+and+blocks+differentiation+of+primary+human+CD34++hematopoietic+cells.">NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells.</a> Cancer Res. , 66-6628 (2006).</li><li>Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+NUP98-DDX10+oncogene+on+primary+human+CD34++cells:+role+of+a+conserved+helicase+motif.">Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif.</a> Leukemia. , (2010).</li><li>Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+transformation+of+primary+human+hematopoietic+cells+by+the+oncogene+NUP98-HOXA9.">Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9.</a> PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).</li><li>Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hematopoietic+colonies+in+health+and+disease.">Human hematopoietic colonies in health and disease.</a> Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).</li><li>Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+colony-forming+cell+assays.">Hematopoietic colony-forming cell assays.</a> Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).</li><li>Coulombel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hematopoietic+stem/progenitor+cells:+strength+and+drawbacks+of+functional+assays.">Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays.</a> Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).</li><li>Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection,+maintenance,+and+differentiation+of+primitive+human+hematopoietic+cells+in+cultures+containing+murine+fibroblasts+engineered+to+produce+human+steel+factor,+interleukin-3,+and+granulocyte+colony-stimulating+factor.">Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Blood. 88, 3765-3773 (1996).</li></ol>

El ensayo de CFC se ha utilizado ampliamente para determinar la proliferación y diferenciación de los patrones de progenitores hematopoyéticos y para estudiar los efectos de los oncogenes (4, 5). Tiene la ventaja sobre los cultivos líquidos de ser un ensayo clonal, de tal manera que las colonias representan la progenie de un solo progenitor y puede ser eliminado de forma individual para su posterior análisis. La limitación de la prueba de CFC es que no es adecuado para la detección de los progenitores más inmadu...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>IMDM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>12440</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>06150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin (PS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FLT-3 ligand</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-19</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GM-CSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SCF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TPO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>300-18</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IL3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>200-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IL6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Peprotech</td>
<td>200-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma- Aldrich</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP118</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Retronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Takara Bio Inc</td>
<td>T100A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>14200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan Blue solution (0.4%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8154</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methocult GF+ H4435</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>04445</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Methylcellulose Enriched Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R &amp; D Systems</td>
<td>HSC005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wright/ Giemsa stain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harleco</td>
<td>64571</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical Company</td>
<td>1450</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A412-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal 60</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>8310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Mouse Serum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rockland Immunochemicals</td>
<td>D208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD11b phycoerythrin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>555388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>551378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>557748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD71 phycoerythrin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>555537</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>551336</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Human CD45 phycoerythrin-Cy7-congjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>557748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24-well non-treated tissue culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>35-1147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 mm non-treated dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>27150 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 mm tissue culture dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gridded scoring dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>27500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>35-2097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>35-2070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringes 3 ml </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>28240</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16 gauge blunt-end, 1&frac12; inch needle </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>28110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 &mu;m CellTrics cell filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Partec</td>
<td>04-004-2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0267110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TPX sample chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>A78710018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon filter cards</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>5991022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon cytospin slide holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>59920063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Complete Staining Assembly 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
<td>34155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 &mu;m filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28307-134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>Diaphot</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>DS-F11</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>BX51 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>DP71</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microtek</td>
<td>Scanmaker 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vortex mixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue culture incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sanyo</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytospin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon</td>
<td>Cytospin 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bench-top centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5810-R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water purification system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Barnstead</td>
<td>Nanopure-Diamond</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

colony forming cell (cfc) assay for human hematopoietic cells

Hematopoyéticas humanas células madre / progenitoras se obtienen generalmente de la médula ósea, sangre del cordón umbilical o sangre periférica y se utilizan para estudiar la hematopoyesis y leucemogénesis. Tienen la capacidad de diferenciarse en linajes linfoides y mieloides. La formación de colonias de células (CFC) de ensayo se utiliza para estudiar la proliferación y el patrón de diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas de su capacidad de formar colonias en un medio semisólido. El número y la morfología de las colonias formadas por un número fijo de células de entrada proporcionan información preliminar sobre la capacidad de los progenitores para diferenciarse y proliferar. Las células pueden ser cosechadas a partir de distintas colonias de la placa entera para evaluar aún más sus números y los estados de diferenciación mediante citometría de flujo y la evaluación morfológica de Giemsa diapositivas. Este ensayo es útil para evaluar la diferenciación mieloide linfoide, pero no. El mieloide término en este contexto se utiliza en su sentido más amplio para abarcar linajes granulocítica, monocítica, eritroide y megacariocítica. Hemos utilizado este ensayo para evaluar los efectos de los oncogenes en la diferenciación de las células humanas primarias CD34 + derivadas de sangre periférica. Para este propósito las células se transducen con la construcción de control, ya sea por retrovirus o un concepto que expresa el oncogén de interés, en este caso-Nup98 Hoxa9. Contamos con un vector retroviral de uso común, MSCV-IRES-GFP, que expresa un mRNA bicistrónico que produce el gen de interés y un marcador GFP. Las células son pre-activado por el aumento en la presencia de citocinas durante dos días antes de la transducción retroviral. Después de dos días, las células GFP + se encuentran aisladas por la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y se mezcla con un medio semisólido que contiene metilcelulosa, complementado con las citocinas y se incuban hasta que las colonias aparecen en la superficie, por lo general 14 días. El número y la morfología de las colonias están documentados. A continuación se retiran las células de las placas, se lavan, se cuentan y sometidos a la citometría de flujo y el examen morfológico. La citometría de flujo con anticuerpos específicos para los marcadores de superficie celular expresadas durante la hematopoyesis proporciona información sobre el linaje y la etapa de maduración. Los estudios morfológicos de las células individuales bajo un microscopio después de Wright-Giemsa tinción de proporcionar más información con respecto a la descendencia y la maduración. Comparación de las células transducidas con el vector de control de vacío a los transducidas con un oncogén revela los efectos del oncogen en la diferenciación hematopoyética.

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Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

La formación de colonias de células (CFC) de ensayo es un ensayo in vitro en progenitores hematopoyéticos que forman colonias en un medio semi-sólido. Una combinación de la morfología de la colonia, la morfología celular y citometría de flujo se utilizan para evaluar la capacidad de los progenitores para proliferar y diferenciarse a lo largo de los diferentes linajes hematopoyéticos.

La formación de colonias de células (CFC) para el ensayo de células hematopoyéticas humanas

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Investigación

Inmunología e Infección

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

El uso de interferón-γ enzimo-inmunoensayo para la Caracterización de Nuevos epítopos de células T del virus del papiloma humano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial células presentadoras de antígenos (KaAPC) para la utilización eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; El agotamiento de células T humanas específicas de antígeno

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...