Name: protocol for dengue infections in mosquitoes (a. aegypti) and infection phenotype determination
Uploaded: 2007-07-04T21:00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination at JoVE.com

א להפיץ את הנגיף בקו C6/36 התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לגדול ל -80% confluency בבקבוק 75 ס&quot;מ 2; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התקשורת עם 3-4 מ&quot;ל הנותרים הבקבוק; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 0.5 מניות וירוס מ&quot;ל ולהוסיף לתוך התא מעל עם ריבוי של 1.5 זיהום חלקיקי הנגיף לכל תא. טלטול את הבקבוק במשך 15 דקות לאט בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 45 דקות ב 5% CO 2 ו - 37 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה 30 מ&quot;ל, ו דגירה במשך 5 ימים. </li></ol> ב הכינו תערובת של הנגיף בדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק התא עם מגרד ולהעביר את תא התקשורת של 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifugate ב 800g במשך 10 דקות, לאסוף את supernatant, אבל להשאיר 1ml של supernatant עם תא גלולה; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את התא גלולה לעיל CO 2 יבש ולאחר מכן להפשיר בתוך 37 ° C אמבט מים, חזרו פעמיים עד שלוש פעמים; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifugate ב 800g במשך 10 דקות, לקחת את supernatant, ולשלב עם supernatant שנאספו בשלב 3; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם אדם שלם עם הליך זהה (שלב 3) להכנת תרבות gametocyte להדביק יתוש האנופלס עם Plasmodium falciparum; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים כמות שווה של דם מעל האנושי כולו עם supernatant הנגיף בשלב 4, ולהוסיף בסרום אדם (10% של נפח כולו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת מעל דם האדם וירוס דנגה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים </li></ol> ג יתושים האכלה הליך זה כמעט זהה מה תוארו בסעיף לטיפול בדלקות Plasmodium falciparum של יתושים. אנו assay את הזיהום midgut ביום 7, ואת זיהום הרוק ביום 14 לאחר האכלה דם. כל החומר בא במגע עם הנגיף מטופלים הראשון עם אתנול 75% ולאחר מכן עם אקונומיקה 10%. ד Assay כייל הנגיף ברקמות יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים או שלושה לפני דיסקציה של רקמת יתושים, לגדול C6/36 תא צלחת 24 גם כך התא להגיע 80% confluency על היום שבו assay מתנהל; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתושים מורדמים ב 4 ° C, הקריבו פני השטח סטרילי ידי טבילתם אתנול 75% למשך דקה 1. אז יתושים נשטפו עם מים סטריליים פעמיים לפני דיסקציה של בלוטת הרוק midgut או מתחת למיקרוסקופ לנתח. מ בשלב זה, את כל ההליך בהמשך צריך להתנהל בסביבה סטרילית כגון ארון בטיחות ביולוגית. רקמות אלו מועברים צינור המכיל 150 μl התקשורת, ומעורים עם גלולה Kontes העלי מנוע עבור 90 שניות; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע דילול 1:100 ידי הוספת 10 μl של homogenate לתוך 990 μl התקשורת; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע עוד 1: 10, 1:100 ו 1:1000 דילול עם המדיום בצלחת 96 היטב; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה צלחת 24 היטב, ולהוסיף 100 μl של כל אחד מארבעת דילולים לעיל גם בכל המקביל; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את הצלחת לאט במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ואז דגירה של 5% במשך 45 דקות CO 2 ו - 37 ° C; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1ml של methycellulose כיסוי (1%) זה טוב; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 5 ימים; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים מכאן והלאה לא דורשים סביבה סטרילית אך כמו כל טיפול אחר הפתוגן צריך להילקח בכל עת. מחק כיסוי methycellulose מהצלחת כל כתם כדי להסיר עודפי התקשורת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1ml של מקבע מתנול / אצטון (1:1) היטב כל אחד. שמור על 4 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את מקבע, ולשטוף פעם עם 1X PBS; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 1:1000 דילול כדי הנוגדן העיקרי נגד הנגיף עם שיכור סחוט 5%; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של נוזל hyperimmune בדילול זה גם C, דגירה על 37 מעלות במשך שעה 1; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת נוזל hyperimmune צלחת לשטוף עם 1 X PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול של 1:1000 המצומד עז אנטי עכבר (חתול KPL # 074-1806) ב 5% שיכור סחוט (5 גרם חלב דל שומן אבקת ב 100 מ&quot;ל של 1 X PBS), ולאחר מכן להוסיף 200 μl זה היטב, דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת המצע כדלקמן: להוסיף 1 טבלית של terrahydrochloride 3&#39;-Diaminobenzidine (חתול Sigma # D5905) בתוך 20 מ&quot;ל של 1 X PBS, לאחר מומס, ולאחר מכן להוסיף 8 μl של peroxidase מימן 30% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של המצע הנ&quot;ל גם כל אחד. בואו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר המצע ולהפסיק התגובה על ידי הוספת 1ml של מים מזוקקים זה טוב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מעל צלחות מים כתם להתייבש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת החלקיקים וירוס </li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>with 5% CO2, 37oC</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>plastic</td>
</tr>
<tr>
<td>human serum and blood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>O+</td>
</tr>
<tr>
<td>pipette tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for tissue culture </td>
</tr>
<tr>
<td>pipettman</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipetts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass, sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>37C</td>
</tr>
<tr>
<td>centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>circulating water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glass membrane feeders</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>with rubber tubing to fit feeders</td>
</tr>
<tr>
<td>mosquito cups</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>75% ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% bleach</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue-culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>6-well, 24-well and 96-well plates</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fine-tip forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X, sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>dissecting microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>C6/36 cells</td>
<td>cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For virus propagation</td>
</tr>
<tr>
<td>C6/36 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.</td>
</tr>
<tr>
<td>3&#x2019;-Diaminobenzidine terrahydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 &#181;l of 30% hydrogen peroxidase</td>
</tr>
<tr>
<td>30% hydrogen peroxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>A. aegypti</td>
<td>Animal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>mosquito</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

protocol for dengue infections in mosquitoes (a. aegypti) and infection phenotype determination

מטרתו של נוהל זה כדי להדביק את היתוש Aedes עם וירוס דנגה בתנאי מעבדה ולבדוק את רמת זיהום דינמי של הווירוס ברקמות יתושים. פרוטוקול זה נמצא בשימוש שגרתי ללימוד יתושים וירוס אינטראקציות, במיוחד עבור זיהוי של גורמים מארח רומן כי הם מסוגלים לקבוע יכולת וקטור. הניסוי כולו צריך להתבצע במעבדה BSL2. בדומה לזיהומים Plasmodium falciparum, בלבוש הולם, כולל כפפות וחלוק מעבדה חייב להיות משוחק בכל עת. לאחר הניסוי, כל החומרים כי בא במגע עם הנגיף צריכים להיות מטופלים עם 75% אתנול ו מולבן לפני שתמשיך עם כביסה רגילה. כל החומרים האחרים צריכים להיות autoclaved לפני השלכת אותם.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination at JoVE.com

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאל הווירוס דנגה, זה חייב להיות מוערך על תפקיד זה במניעת זיהומים נגיפיים בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים דנגה של יתושים יכול להיות assayed. שיטות לגידול את הנגיף בתרבית, האכלה קרום דם יתושים אדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

פרוטוקול זיהומים דנגי ב יתושים (א aegypti) ו הפנוטיפ קביעת זיהום

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

פרוטוקול זיהומים Plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Dissection של בלוטות הרוק midgut ו מ AE. aegypti יתושים

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

למנוע את התפשטות המלריה וקדחת דנגי באמצעות יתושים מהונדסים גנטית

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

בניית יתוש עדיף: זיהוי הגנים הפעלת מלריה קדחת דנגי ההתנגדות ב א gambiae וא aegypti יתושים

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi בתיווך ג&#39;ין מציאה ו<em&gt; In vivo</em&gt; Diuresis Assay ב נקבה בוגרת<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; יתושים

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

שמירה על Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

פרוטוקול עבור המעבדה דיור של טורקיז דגים גמבוזיים (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...