Name: protocol for dengue infections in mosquitoes (a. aegypti) and infection phenotype determination
Uploaded: 2007-07-04T21:00:00
Duration: 15 min 25 s
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A. Propagar vírus na linhagem de células C6/36. <ol><li> Células crescem a 80% confluência em 75 frasco cm 2; </li><li> Remova a mídia com 3-4 ml que fica no frasco; </li><li> Tomar 0,5 ml do vírus estoque e adicionar na célula acima, com a multiplicidade de infecção de 1,5 partículas de vírus por célula. Agitar o frasco durante 15 minutos lentamente na temperatura ambiente. </li><li> Incubar por 45 minutos em 5% CO 2 e 37 ° C </li><li> Adicionar 30 ml de mídia, e incubar por 5 dias. </li></ol> B. Prepare a mistura de vírus e de sangue <ol><li> Retire a célula com o raspador e transferir o celular e mídia para os 50 mL tubos cônicos; </li><li> Centrifugado a 800g por 10 minutos; coletar o sobrenadante, mas deixar 1ml do sobrenadante com o pellet celular; </li><li> Congelar o pellet celular acima das emissões de CO 2 e, em seguida, secar descongelar em banho-maria 37 ° C, repita duas a três vezes; </li><li> Centrifugado a 800g por 10 minutos, retirar o sobrenadante, e combinam com o sobrenadante do passo 3; </li><li> Coletar sangue humano total com o mesmo procedimento (passo 3) para a preparação da cultura gametócitos para infectar mosquitos Anopheles com Plasmodium falciparum; </li><li> Combinar a quantidade igual de todo o sangue acima do humano com o vírus sobrenadante do passo 4, e adicionar soro humano (10% do volume total). </li><li> Incubar a mistura acima de sangue humano e vírus da dengue durante 30 minutos a 37 ° C banho de água </li></ol> Alimentação mosquitos C. Este procedimento é quase idêntico ao que foi descrito na seção de infecções Plasmodium falciparum em mosquitos. Nós ensaio a infecção do intestino médio no dia 7, ea infecção salivar em 14 dias após a sangue-feeding. Todo o material que entrou em contato com o vírus são tratados pela primeira vez com etanol 75% e depois com lixívia a 10%. D. Ensaio o título do vírus no tecido mosquito <ol><li> Dois ou três dias antes da dissecação de tecido mosquito, crescer C6/36 célula em uma placa de 24 poços de tal forma que a célula de chegar a 80% confluência no dia em que o ensaio é realizado; </li><li> Os mosquitos são anestesiados a 4 ° C, sacrificados e surgiu estéril, mergulhando-os em etanol 75% por 1 minuto. Em seguida, os mosquitos foram lavados com água estéril duas vezes antes de dissecção da glândula salivar do intestino médio ou sob o microscópio de dissecação. A partir deste passo, todo o procedimento a seguir deve ser conduzido em um ambiente estéril, como uma cabine de segurança biológica. Estes tecidos são transferidos para um tubo contendo 150 mL de mídia e homogeneizados com uma pelota Kontes pilão do motor por 90 segundos; </li><li> Fazer uma diluição de 1:100, adicionando 10 ml do homogenato em media 990 mL; </li><li> Fazer mais um: 10, 1:100 e 1:1000 de diluição com o meio na placa de 96 poços; </li><li> Remova a mídia na placa de 24 poços, e adicione 100 ml de cada uma das diluições acima de quatro em cada cavidade correspondente; </li><li> Agite a placa lentamente por 15 minutos na temperatura ambiente, em seguida, incubar por 45 minutos em 5% CO 2 e 37 ° C; </li><li> Adicionar 1 ml de Metilcelulosa overlay (1%) a cada poço; </li><li> Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 5 dias; </li><li> Os passos a partir daqui não requerem um ambiente estéril, mas como com qualquer outro cuidado deve ser tomado patógeno em todos os momentos. Descartar overlay Metilcelulosa de cada prato e blot para remover excesso de mídia </li><li> Adicionar 1 ml de metanol / acetona fixador (1:1) a cada poço. Manter a 4 ° C por 1 h; </li><li> Deitar fora o fixador, e lave uma vez com 1X PBS; </li><li> Faça 1:1000 diluição para o anticorpo primário contra o vírus com Blotto 5%; </li><li> Adicionar 200 mL de líquido hiperimune diluído a cada C bem, incubar a 37 ° para 1 hora; </li><li> Remover o líquido hiperimune e placa de lavagem com PBS 1 X </li><li> Prepare uma diluição 1:1000 do conjugado de cabra anti-rato (KPL Cat # 074-1806) em 5% dopada (5g de leite em pó desnatado em 100 ml de PBS 1 X), e depois adicionar 200 mL em cada poço e incubar a 37 ° C por 1 h; </li><li> Prepare substrato da seguinte forma: adicionar 1 comprimido de 3&#39;-diaminobenzidina terrahydrochloride (Sigma Cat # D5905) em 20 ml de PBS 1 X, depois de dissolvido, e então adicionar 8 mL de peróxido de hidrogênio 30% </li><li> Adicionar 200 mL do substrato acima para cada poço. Deixe descansar em temperatura ambiente por 10 minutos </li><li> Remover substrato e parar a reação pela adição de 1ml de água destilada para cada poço </li><li> Despeje em pratos de água e secar para secar </li><li> Contar a partícula do vírus </li></ol>

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>with 5% CO2, 37oC</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>plastic</td>
</tr>
<tr>
<td>human serum and blood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>O+</td>
</tr>
<tr>
<td>pipette tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for tissue culture </td>
</tr>
<tr>
<td>pipettman</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipetts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass, sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>37C</td>
</tr>
<tr>
<td>centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>circulating water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glass membrane feeders</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>with rubber tubing to fit feeders</td>
</tr>
<tr>
<td>mosquito cups</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>75% ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% bleach</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue-culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>6-well, 24-well and 96-well plates</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fine-tip forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X, sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>dissecting microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>C6/36 cells</td>
<td>cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For virus propagation</td>
</tr>
<tr>
<td>C6/36 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.</td>
</tr>
<tr>
<td>3&#x2019;-Diaminobenzidine terrahydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 &#181;l of 30% hydrogen peroxidase</td>
</tr>
<tr>
<td>30% hydrogen peroxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>A. aegypti</td>
<td>Animal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>mosquito</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

protocol for dengue infections in mosquitoes (a. aegypti) and infection phenotype determination

O objetivo deste procedimento é para infectar o mosquito Aedes com o vírus da dengue em uma condição de laboratório e examinar o nível de infecção e dinâmica do vírus nos tecidos do mosquito. Este protocolo é utilizado rotineiramente para o estudo de interações mosquito-vírus, especialmente para a identificação de novos fatores de host que são capazes de determinar a competência vetorial. Todo o experimento deve ser realizado em um laboratório BSL2. Semelhantes às infecções Plasmodium falciparum, traje apropriado, incluindo luvas e jaleco deve ser usado em todos os momentos. Após o experimento, todos os materiais que entraram em contato com o vírus precisam ser tratados com etanol 75% e branqueadas antes de prosseguir com a lavagem normal. Todos os outros materiais devem ser autoclavados antes de descartá-los.

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Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Uma vez que um gene é identificada como potencialmente refratário para o vírus da dengue, deve ser avaliado para o seu papel na prevenção de infecções virais dentro do mosquito. Este protocolo ilustra como a extensão das infecções por dengue de mosquitos podem ser ensaiadas. As técnicas para crescer o vírus em cultura, alimentando-se membrana de sangue os mosquitos humanos e assaying títulos viral no intestino médio do mosquito são demonstradas.

Protocolo para infecções por dengue em mosquitos (A. aegypti) e Determinação Fenótipo Infecção

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

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Protocolo para Infecções Plasmodium falciparum em mosquitos e Infecção Determinação Fenótipo

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