Name: protocol for dengue infections in mosquitoes (a. aegypti) and infection phenotype determination
Uploaded: 2007-07-04T21:00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination at JoVE.com

А. Распространить вирус в C6/36 клеточной линии. <ol><li> Клетки растут на 80% слияния в 75 см 2 колбы; </li><li> Удалить средах с 3-4 мл, оставшихся в колбу; </li><li> Возьмите 0,5 мл фондовом вирусов и добавить в выше ячейки с множественностью заражения 1,5 вирусных частиц в клетку. Встряхивания колбы в течение 15 минут медленно при комнатной температуре. </li><li> Инкубировать 45 минут при 5% СО 2 и 37 ° C </li><li> Добавить 30 мл средствах массовой информации, и выдержать в течение 5 дней. </li></ol> Б. Подготовка смеси вируса и крови <ol><li> Отсоедините ячейки с скребок и передачи ячейки и СМИ 50 мл конические пробирки; </li><li> Центрифугата на 800 г в течение 10 минут; собирают супернатант, но оставить 1 мл надосадочной с осадок клеток; </li><li> Стоп выше осадок клеток в сухом CO 2, а затем оттепель в 37 ° С водяной бане, повторить два-три раза; </li><li> Центрифугата на 800 г в течение 10 минут, принимать супернатант, и в сочетании с надосадочной собранных с шага 3; </li><li> Сбор цельной человеческой крови с той же процедурой (шаг 3) для подготовки гаметоцит культуры инфицировать малярийных комаров с Plasmodium тропической; </li><li> Смешайте равное количество выше цельной человеческой крови с вирусом супернатант с шага 4, а также добавить сыворотке крови человека (10% от всего объема). </li><li> Инкубируйте выше смесь крови человека и вируса денге в течение 30 минут при 37 ° С водяной бане </li></ol> Комаров С. Кормление Эта процедура почти идентична той, что были описаны в разделе Plasmodium инфекций в тропической комаров. Мы анализа кишки инфекции на 7 день, и слюнных инфекции на 14 день после того, питающимися кровью. Все материалы, которые были в контакте с вирусом рассматриваются сначала с 75% этанола, а затем с 10% гипохлоритом натрия. Д. Анализ титра вируса в тканях комара <ol><li> Два или три дня до рассечения тканей комара, растут C6/36 ячейки в 24-луночный планшет так, что клетка достигает 80% слияния в день, когда анализ проводится; </li><li> Комары анестезии при 4 ° С, жертвы и всплыли стерильной путем замачивания их в 75% этаноле в течение 1 минуты. Затем комаров промывали стерильной водой дважды, прежде чем рассечения кишки или слюнных желез при вскрытии микроскопом. С этого шага все ниже процедуру необходимо проводить в стерильных условиях, таких как биологические кабинета безопасности. Эти ткани переданы пробирку, содержащую 150 мкл СМИ и гомогенизировали с Kontes гранул пестиком двигателя в течение 90 секунд; </li><li> Сделать 1:100 разбавления путем добавления 10 мкл гомогената в 990 мкл средствах массовой информации; </li><li> Сделайте еще 1: 10, 1:100 и 1:1000 разбавления среды в 96 ячейках; </li><li> Удалить средств массовой информации в 24-луночный планшет, и добавьте 100 мкл каждого из этих четырех разведениях к каждому из которых соответствует хорошо; </li><li> Встряхните пластины медленно в течение 15 минут при комнатной температуре, затем инкубировать 45 минут при 5% СО 2 и 37 ° С; </li><li> Добавить 1 мл methycellulose наложения (1%) в каждую лунку; </li><li> Инкубируйте пластин при 37 ° C с 5% CO 2 в течение 5 дней; </li><li> Шагах отсюда на не требующие стерильных условиях, а как с любой другой возбудитель следует проявлять осторожность во все времена. Отменить methycellulose наложения друг от пластины и промокните, чтобы удалить излишки средства массовой информации </li><li> Добавить 1 мл метанола / ацетон фиксатором (1:1) в каждую лунку. Хранить при температуре 4 ° С в течение 1 ч; </li><li> Вылейте фиксатора, и мыть один раз 1X PBS; </li><li> Сделать 1:1000 разбавления до первичного антитела против вируса с 5% пьяный; </li><li> Добавьте 200 мкл разведенной гипериммунных жидкости в каждую лунку, инкубировать при температуре 37 ° С в течение 1 ч; </li><li> Удалить гипериммунных жидкость и промыть пластины с 1 х PBS </li><li> Подготовка 1:1000 разбавления антимышиного сопряжены (КПЛ Cat # 074-1806) в 5% одурманенный (5 г порошкообразного обезжиренное молоко в 100 мл 1 х PBS), а затем добавить 200 мкл в каждую лунку и инкубировать в 37 ° С в течение 1 ч; </li><li> Подготовка субстрата следующим образом: добавить по 1 таблетке 3 &#39;диаминобензидина terrahydrochloride (Sigma Cat # D5905) в 20 мл 1 х PBS, после растворения, а затем добавить 8 мкл 30% водорода пероксидазой </li><li> Добавить 200 мкл выше субстрата в каждую лунку. Дайте постоять при комнатной температуре в течение 10 минут </li><li> Удалите подложку и остановить реакцию добавлением 1 мл дистиллированной воды в каждую лунку </li><li> Слейте воду и промокните пластин высохнуть </li><li> Граф вирусной частицы </li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>with 5% CO2, 37oC</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>plastic</td>
</tr>
<tr>
<td>human serum and blood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>O+</td>
</tr>
<tr>
<td>pipette tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for tissue culture </td>
</tr>
<tr>
<td>pipettman</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipetts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass, sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>37C</td>
</tr>
<tr>
<td>centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>circulating water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glass membrane feeders</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>with rubber tubing to fit feeders</td>
</tr>
<tr>
<td>mosquito cups</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>75% ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% bleach</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue-culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>6-well, 24-well and 96-well plates</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fine-tip forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X, sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>dissecting microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>C6/36 cells</td>
<td>cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For virus propagation</td>
</tr>
<tr>
<td>C6/36 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.</td>
</tr>
<tr>
<td>3&#x2019;-Diaminobenzidine terrahydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 &#181;l of 30% hydrogen peroxidase</td>
</tr>
<tr>
<td>30% hydrogen peroxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>A. aegypti</td>
<td>Animal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>mosquito</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

protocol for dengue infections in mosquitoes (a. aegypti) and infection phenotype determination

Целью этой процедуры является заразить комаров Aedes с вируса денге в лабораторных условиях и изучить уровень инфекции и динамика вируса в организме комара тканей. Этот протокол широко используется для изучения комаров вирус взаимодействия, особенно для идентификации новых факторов хозяина, которые способны определить вектор компетенции. Весь эксперимент должен проводиться в лаборатории BSL2. Как и Plasmodium тропической инфекции, соответствующая одежда, включая перчатки и халат следует носить в любое время. После эксперимента все материалы, которые были в контакте с этим вирусом, должны рассматриваться с 75% этанола и беленой прежде чем приступить к нормальной стирки. Все остальные материалы должны обрабатываться в автоклаве, прежде чем выбросить их.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination at JoVE.com

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Как только ген определены как потенциально огнеупорные для вируса денге, он должен быть оценен для его роль в профилактике вирусных инфекций в комара. Этот протокол иллюстрирует, как степень инфицирования денге комаров могут быть проанализированы. Методы для посадки у вируса в культуре, мембранные кормления комаров человеческой крови, и опробование вирусные титры в комара кишки демонстрируются.

Протокол денге инфекций в Комары (A. aegypti) и определение инфекции Фенотип

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Микроинъекция А. Эмбрионы aegypti получить Трансгенные комары

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Протокол Plasmodium Инфекции в тропической Определение фенотипа Комары и инфекции

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Препарирование Средняя кишка и слюнных желез от Ae. aegypti комаров

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Протокол Анализы RNAi у взрослых комаров (А. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

Предотвращение распространения малярии и лихорадки денге с использованием генетически модифицированных комаров

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

Строительство Лучше Mosquito: Идентификация генов Включение малярия и лихорадка денге Сопротивления в gambiae А. и А. aegypti комаров

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-опосредованной Нокдаун гена и<em&gt; В Vivo</em&gt; Анализ Диурез в взрослых женщин<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Комары

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Анализ Multi-обнаружения малярии комарами

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Поддержание инфицированных комаров Aedes aegypti с Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Протокол для лабораторных жилья из бирюзы Пецилиевые рыбы (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...