Name: protocol for dengue infections in mosquitoes (a. aegypti) and infection phenotype determination
Uploaded: 2007-07-04T21:00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination at JoVE.com

A. Sprid viruset i C6/36 cellinje. <ol><li> Celler växer till 80% confluency i 75 cm 2 kolv; </li><li> Ta bort materialet med 3-4 ml kvar i flaskan; </li><li> Ta 0,5 virus ml lager och lägga in ovanstående cell med den mångfald av infektion på 1,5 viruspartiklar per cell. Skaka kolven i 15 minuter långsamt vid rumstemperatur. </li><li> Inkubera 45 minuter vid 5% CO 2 och 37 ° C </li><li> Tillsätt 30 ml media och inkubera i 5 dagar. </li></ol> B. Förbered blandning av virus och blod <ol><li> Lossa cellen med skrapan och överföra cellen och media till 50 ml koniska rör; </li><li> Centrifugat vid 800 gi 10 minuter, samla in supernatanten, men lämna 1 ml av supernatanten med cellpelleten; </li><li> Frys ovanstående cellpelleten i torr CO 2 och sedan tina i 37 ° C vattenbad, upprepa två till tre gånger; </li><li> Centrifugat vid 800 gi 10 minuter, ta supernatanten, och kombinera med supernatanten samlas in från steg 3; </li><li> Samla helblod med samma förfarande (steg 3) för beredning av gametocyte kultur att infektera Anopheles mygga med Plasmodium falciparum, </li><li> Kombinera lika mycket av ovanstående helblod med virus supernatanten från steg 4, och lägg humant serum (10% av hela volymen). </li><li> Inkubera ovanstående blandning av humanblod och denguefeber virus i 30 minuter vid 37 ° C vattenbad </li></ol> C. Utfodring myggor Detta förfarande är nästan identiskt med vad som har beskrivits i avsnittet för Plasmodium falciparum infektioner i myggor. Vi Analysera midgut infektion vid dag 7 och saliv infektion vid dag 14 efter blod-matning. Allt material som kom i kontakt med viruset behandlas först med 75% etanol och därefter med 10% blekmedel. D. Analysera viruset titer i mygga vävnad <ol><li> Två eller tre dagar innan dissekering av mygga vävnad, växer C6/36 cell i en 24 brunnar så att cellen når 80% confluency på den dag då analysen sker; </li><li> Myggor bedövas vid 4 ° C, offrade och ytbehandlade sterila genom att blötlägga dem i 75% etanol i 1 minut. Sedan mygg spolades med sterilt vatten två gånger innan dissekering av midgut eller salivkörtlarna under dissekera mikroskop. Från detta steg, behöver all proceduren nedan för att föras i en steril miljö som en biologisk säkerhet skåp. Dessa vävnader överförs till ett rör som innehåller 150 l media och homogeniseras med en Kontes pellets mortelstöt motor för 90 sekunder; </li><li> Gör en 1:100 utspädning genom att tillsätta 10 ìl av homogenatet till 990 l medier; </li><li> Gör ytterligare 1: 10, 1:100 och 1:1000 spädning med mediet i 96 brunnar; </li><li> Ta bort materialet i 24 brunnar, och tillsätt 100 l av varje av ovanstående fyra utspädning för att varje motsvarande väl; </li><li> Skaka plattan sakta i 15 minuter vid rumstemperatur, sedan inkubera 45 minuter vid 5% CO 2 och 37 ° C; </li><li> Tillsätt 1 ml methycellulose overlay (1%) i varje brunn; </li><li> Inkubera plattorna vid 37 ° C med 5% CO 2 i 5 dagar; </li><li> Stegen härifrån om inte kräver en steril miljö men som med alla andra patogen försiktighet bör iakttas vid alla tillfällen. Kasta methycellulose overlay från varje tallrik och blot för att avlägsna överskott medier </li><li> Tillsätt 1 ml metanol / aceton fixativ (1:1) i varje brunn. Förvara vid 4 ° C under 1 timme; </li><li> Häll av fixativ och tvätta en gång med 1X PBS; </li><li> Gör 1:1000 spädning för den primära antikroppen mot viruset med 5% ASFULL; </li><li> Tillsätt 200 l utspädd hyperimmunserum vätska till varje brunn, inkubera vid 37 ° C under 1 timme; </li><li> Ta bort hyperimmunserum vätska och tvätta plattan med 1 X PBS </li><li> Förbered en 1:1000 spädning av get-anti-mus-konjugat (KPL Cat # 074-1806) i 5% ASFULL (5g pulver skumma mjölk i 100 ml 1 X PBS), och lägg sedan till 200 l till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 1 timme; </li><li> Förbered underlaget på följande sätt: tillsätt 1 tablett 3&#39;-Diaminobenzidin terrahydrochloride (Sigma Katt # D5905) i 20 ml 1 X PBS, efter upplöst, och sedan lägga till 8 l av 30% väte peroxidas </li><li> Tillsätt 200 l av ovanstående substrat till varje brunn. Låt stå i rumstemperatur i 10 minuter </li><li> Ta bort substrat och stoppa reaktionen genom att tillsätta 1 ml destillerat vatten i varje brunn </li><li> Häll bort vatten och torka plattorna torka </li><li> Räkna viruspartikeln </li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>with 5% CO2, 37oC</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>plastic</td>
</tr>
<tr>
<td>human serum and blood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>O+</td>
</tr>
<tr>
<td>pipette tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for tissue culture </td>
</tr>
<tr>
<td>pipettman</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipetts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass, sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>37C</td>
</tr>
<tr>
<td>centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>circulating water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glass membrane feeders</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>with rubber tubing to fit feeders</td>
</tr>
<tr>
<td>mosquito cups</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>75% ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% bleach</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue-culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>6-well, 24-well and 96-well plates</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>glass</td>
</tr>
<tr>
<td>Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fine-tip forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X, sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>dissecting microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>C6/36 cells</td>
<td>cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For virus propagation</td>
</tr>
<tr>
<td>C6/36 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.</td>
</tr>
<tr>
<td>3&#x2019;-Diaminobenzidine terrahydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 &#181;l of 30% hydrogen peroxidase</td>
</tr>
<tr>
<td>30% hydrogen peroxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>A. aegypti</td>
<td>Animal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>mosquito</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

protocol for dengue infections in mosquitoes (a. aegypti) and infection phenotype determination

Syftet med detta förfarande är att infektera Aedes mygga med denguefeber virus i ett laboratorium skick och undersöka infektionen nivån och dynamiska av viruset i mygga vävnader. Detta protokoll används rutinmässigt för att studera mygga-virus interaktioner, särskilt för identifiering av faktorer roman värd som skall kunna avgöra vektor kompetens. Hela experimentet måste utföras i en BSL2 laboratorium. I likhet med Plasmodium falciparum infektioner, måste korrekt klädsel, inklusive handskar och laboratorierock användas vid alla tillfällen. Efter experimentet, allt material som kom i kontakt med viruset måste behandlas med 75% etanol och blekt innan du fortsätter med vanlig tvätt. Alla andra material måste autoklaveras innan kasta dem.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination at JoVE.com

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

När en gen har identifierats som potentiellt eldfasta för denguefeber virus, måste det utvärderas för sin roll för att förebygga virusinfektioner inom mygga. Detta protokoll visar hur omfattningen av denguefeber infektioner av myggor kan analyseras. De tekniker för att odla fram viruset i kulturen, membran utfodring myggor blod, och testmetoder för virus titer i myggans midgut demonstreras.

Protokoll för Dengue Infektioner i Myggor (A. aegypti) och infektion Fenotyp Fastställande

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Mikroinjektion av A. aegypti Embryon Skaffa Transgena myggor

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Protokoll för Plasmodium falciparum Infektioner i Myggor och infektion Fenotyp Fastställande

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Dissekering av midgut och spottkörtlar från AE. aegypti Myggor

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Protokoll för RNAi-tester på vuxna myggor (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

Förhindra spridning av malaria och denguefeber att använda genetiskt modifierade myggor

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

Bygga en bättre Mosquito: Identifiera gener Aktivera malaria och denguefeber Motståndet i A. gambiae och A. aegypti myggor

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated gene Knockdown och<em&gt; In Vivo</em&gt; Diures Analys hos vuxna kvinnliga<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Myggor

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-detektion analys för Malaria Överföring Myggor

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Att upprätthålla Aedes aegypti myggor infekterade med Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Ett protokoll för laboratoriet bostäder av turkos Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...