Name: preparation of highly coupled rat heart mitochondria
Uploaded: 2010-09-23T17:30:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria at JoVE.com

אנו מודים פרופ &#39;וינוגרדוב וד&quot;ר ורה Grivennikova עבור המבוא של המחברים לתחום הביולוגיה המיטוכונדריה תובנות ועצות שימושיות רבות בהליך זה. המחברים מודים לגברת אמנדה McKintock ממשרד התקשורת מאוניברסיטת קווינס על העזרה בהכנת וידאו.

הקדמה המיטוכונדריה מהלב עכברוש הוא אחד הנפוצים ביותר ההכנות ללימודים בעבר ובהווה של חילוף החומרים התאי. הם ניתן להשיג במהירות ובאופן אמין בכמות גדולה מן סוג בר או עקום החוצה וחיות. הנוהל הכללי מורכב לעיכול רקמת על ידי חלוקה טריפסין, ו צנטריפוגה ההפרש. ישנם כמה תנאים שצריכים להישמר במהלך בידוד של המיטוכונדריה מרקמות שונות, כולל הלב (איור 1). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת צריך להיות טחון היטב, שכן הוא משפיע ישירות על תשואה של המיטוכונדריה שהושגו. רקמת הלב עדיף לקצץ במספריים מעוגלים קטנים ניתן ואחריו להשתמש במטחנת רקמות Latapie או, אם מטחנת רקמה אינו זמין, עיתונאים שום בקוטר מוצא חורים בקוטר של כ 1.0 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה הכרחי כדי לשמור על טמפרטורה של פתרונות בכל שלב. לכן התהליך כולו צריך להתבצע בחדר קר, וכל המכשירים פתרונות להיות מוכן ומקורר מראש. אם תנאי הטמפרטורה לא נשמרים מספר מאפיינים יציבים של התכשיר ניתן לאיבוד. מבנה מיטוכונדריאלי רגיש מאוד הקפאת כך overfreezing של ההשעיה (למשל במהלך צנטריפוגה) אינה מותרת, במיוחד אם מחקרים התחבורה פעיל חשובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטר חשוב הוא הזמן הארוך של ההליך; הבידוד יש לבצע במהירות האפשרית והכנת שהושגו יש להשתמש מיד. לכן, כירורגית כלי נגינה, פתרונות ומוצרי צריכה להיות מוכנה מראש. </li></ul> חומרים ומכשירים מכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים ההפעלה סטרייט, נקודה חדה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Curved מספריים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצבטים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת פטרי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משפך קטן + חתיכת ניילון המסנן (prewashed) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 כוסות 50 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני stirrers מגנטי ושתי אמבטיות קרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת קרח גדול באמבטיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מוטות מגנטיים קטנים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ומדיות עבור גלולה גירוד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ Latapie רקמות (ניתן להחליף עם העיתונות השום) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפלון זכוכית homogenisers 20ml ו 1-2ml </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פסולת כוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Eppendorf צינורות להשעיה המיטוכונדריה דגימות הסופי לקביעת חלבון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבטיות קרח </li></ol> פתרונות (מחושב לפי 2 חולדות): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ כביסה: 0.3 סוכרוז M, 10 HEPES מ&quot;מ (pH = 7.2), 0.2 mM EDTA (1000 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ בידוד: 0.3 סוכרוז M, HEPES 10 מ&quot;מ (pH = 7.4), 0.2 mM EDTA, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BSA (Sigma A6003) (100 מ&quot;ל שהוכן למאגר כביסה). סרום אלבומין שור ניתן להחליף על ידי פחות יקר נטול חומצה אנלוגים שומן. המאגר זהה או וריאציות שלה איזוטוני יכול לשמש חיץ Resuspending. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריפסין (Sigma T8003) פתרון: 2.5mg/ml ב 1mm HCl (0.5 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעכבי טריפסין מסויה שעועית (Sigma T9128) mg/10 6.5 מ&quot;ל של חיץ בידוד </li></ol> פרוטוקול התוכנית הכללית של ההליך מוצג באיור. 1. לבבות צריך להיות מקורר לרחוץ כביסה, חיץ רקמות חדרית נכרת, טחון homogenised במהלך הטיפול photolytic עם טריפסין. ההשעיה היא centrifuged במהירות נמוכה ואת supernatant המתקבל centrifuged שוב במהירות גבוהה יותר כדי לאסוף את המיטוכונדריה. בהתאם הניסויים המתוכננת למאגר resuspending יכול להיות מוחלף על ידי כל פתרון איזוטוני אחרים. בעלי חיים הופסקה בהתאם בבריטניה &quot;חיות (הליכים מדעיים) לחוק.&quot; על ידי נקע בצוואר הרחם בעקבות עריפת ראש. זה הכרחי כדי לחלץ את הלב מיד לאחר עריפת ראש של חיה, כך שאין עיכוב בין סיום החי מיצוי לב. אם הבידוד מקביל של הכבד המיטוכונדריה צפוי החולדות צריך להיות בצום לילה לפני הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין שלושה כוסות המכילות 40 מ&quot;ל של הצפת כביסה. מגניב אותם באמבט קרח מלח במשך 3-5 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא. ודא שלא overfreeze אותם ולהשתמש מיד אחרי עננים של גבישי קרח מתחילים להופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את בית החזה של עכברוש הכרות ולחלץ את הלב. ודא חתכים קטנים ומיד להעביר את הלב פתרון הקר כקרח בכוס הראשונה. חונק את הלב כדי להסיר דם והכניס אותו לתוך הכוס השנייה. חזור על פעולה זו עבור כל הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את ליבם על הנייר את המסנן. הסר את כל הדם שומן קרוש, auricles ו fasciae ובריכת רקמת חדרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את הרקמה ונקווה במספריים מעוגלים קטנים על צלחת פטרי על קרח דק סביב 5 עד גודל החלקיקים הוא כ 1-2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את רקמות טחון לתוך העיתונות רקמות לעבוראותה דרך. שים לב כי כמות משמעותית של החומר יכול להישאר בעיתונות כך לאסוף את כל רקמת לב מהקירות התחתונה של העיתונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חומר לתוך כוס עם הצפת 50 מ&quot;ל כביסה ומערבבים. ואז לסנן את ההשעיה דרך מסנן ניילון. שטפו את הרקמה טחון על 3 פעמים עם מסנן למאגר כביסה לבטל את תסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמות נסחפו לתוך 20 מ&quot;ל של הצפת כביסה ולמקם אותו באמבט קרח על stirrer המגנטי. הוסף 0.5 מ&quot;ל של תמיסת טריפסין תחת בחישה מתמדת להפעיל את הטיימר. הכן עוד stirrer מגנטי, אמבט קרח וכוס second 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקה ה 4 homogenise בקצרה את החלק ההשעיה על ידי שימוש בחלק קטן מצויד באופן רופף זכוכית טפלון homogeniser (10-15 מ&quot;ל) עם כמה משיכות מעלה ומטה כדי לפזר את ההשעיה. לאחר homogenisation להעביר את ההשעיה לתוך הכוס השנייה. חזור על נוהל על בדקה ה 9, כך שתוכל לבצע את homogenisation ההשעיה שתי פעמים בסך הכל. לאחר 15 דקות של דגירה, להוסיף 10 מ&quot;ל של בידוד המכיל מאגר מעכב טריפסין ו דגירה דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה שוב דרך פילטר ניילון ולשמור את תסנין. איסוף החלקיקים חלק שמאל על לסנן homogenise דקות 1 ב 15-20 מ&quot;ל של הצפת כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את homogenate עם תסנין ו צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 600g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לסנן את supernatant שנוצר לתוך צינור צנטריפוגות חדשות. הימנע זיהום על ידי גלולה ו צנטריפוגות שוב במשך 15 דקות ב 8500g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה במהירות גבוהה להתעלמות supernatant ולשטוף את 2-3 פעמים גלולה עם 1 מ&quot;ל של השלכת למאגר שכבת לבנות ורכות שפת החיצונית. לשבור את גלולה עם המרית אלא למנוע את הכתם האדום של אריתרוציטים בתחתית. אם בתאי הדם יש לוס, להסיר את פיסות אדום ההשעיה לפני homogenisation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם homogeniser קטנה או לחילופין על ידי pipetting עדין. לדלל את ההשעיה עם Isolationbuffer יותר צנטריפוגות שוב במשך 15 דקות ב 8500g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspend גלולה ב Resuspending הצפת (חיץ איזוטוני של בחירה) ו צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוצאה מכך חום גלולה המכילה מיטוכונדריה שלם נשטף. Resuspend גלולה בנפח קטן מאוד של חיץ איזוטוני על פי בחירתך. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Scheme הוכחת צעד אחר צעד בהליך של בידוד של הלב חולדה המיטוכונדריה. חלק למעלה, שלבים 1-9: שיבוש רקמות, טיפול homogenisation טריפסין ו; החלק התחתון, בשלבים 10-15: צנטריפוגה ההפרש.

<ol>
	<li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+heart+mitochondria:+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation.">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li><li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes:+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria.">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול מהיר מפורטות הבידוד של המיטוכונדריה שלם עם רמה גבוהה של צימוד מתואר. הכנה שהושגו יכול לשמש למחקר פונקציונלי או מבניים על bioenergetics הסלולר, מחקרים proteomic או ניתוח הדנ&quot;א המיטוכונדרי ותוכן השומנים. מחקרים Biophysical תחבורה פעילה של יונים ביניים מטבולי ניתן גם לבצע. אפשר להמשיך בתהליך ההכנה המיטוכונדריה כדי לבודד את חלקיקי submitochondrial, הממברנה החיצונית או רכיבים נפרדים לטהר של זרחון חמצוני. השיטה המתוארת הוא שינוי של הפרוטוקול הסטנדרטי של בידוד על ידי יעקובוס ו סאקס 1. התשואה הצפויה של המיטוכונדריה מוכן הוא כ 10-15 מ&quot;ג של חלבון לכל המיטוכונדריה לב ויחס השליטה על הנשימה Malate / גלוטמט הכנה כזה נע בין 8-12 עם הנשימה IV מדינת סביב 0.12 μmol O 2 חלבון xmin xmg -1 -1 ב 23 ° C במדיום המהווים 0.25 סוכרוז M, 10 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 5 mM אשלגן זרחתי (pH 8.0) עם 150 מיקרומטר ADP לנשימה חניכה III המדינה (על תנאי הניסוי ותוספות המדויק, לראות נ&quot;צ . 2). תשומת לב מיוחדת יש לתת פרטים טכניים אחדים לפני תחילת ההליך בבידוד. זה חיוני כדי להשתמש לנקות צינורות פוליפרופילן או פוליקרבונט צנטריפוגות, ולכן צינורות יש לשטוף ביסודיות עם מברשת נקייה ומים חמים, אולם הטיפול אבקת צריך להישמר לכל הפחות. כמו כן, עדיף לאסוף את כל כלי זכוכית וכלי הכרחי בחדר קר יום לפני הבידוד. במהלך הבידוד בעת העברת מאגרים של צלוחיות על כוסות, תשומת לב מיוחדת а יש לתת למנוע טיפות של מי קרח לתוך הפתרונות. כאשר הטיפול ברקמות יש להדגיש כי עקירת הלב צריך להתבצע בהקדם האפשרי מאז אפילו קצרת זמן העיכוב בין עריפת ראש של החיה וקירור רקמת תביא המיטוכונדריה זוגיים חלקית. קירור מהיר ושטיפת יסודית של לבבות להסיר חיונית כדי להשיג הכנה רגילה, ללא המוגלובין NADase כדורית אדומה. טריפסין משמש השפלה חלבונים החיבור להגדיל את הרגישות של הרקמות לכפות הגז במהלך homogenisation. חשיפה ממושכת של הרקמה כדי פרוטאז יש להימנע שכן התוצאות במיטוכונדריה של איכות נחותה. לאחר centrifugations מהירות גבוהה הקירות של צינורות צנטריפוגה יש לנגב עם נייר טישו כדי להסיר כל הפיקדונות של חומר השומן שהצטבר על הקירות. עבור resuspension הסופי עדיף להשתמש בנפח נמוך של המאגר הסופי על מנת למזער אובדן של פונקציות המיטוכונדריה במהלך האחסון (150-200 μl של המאגר בכל לב). עבור מחקרים של הובלה של קטיונים divalent לא סוכני chelating חייבים להיות נוכחים לקראת הגמר המיטוכונדריה ולכן יש לשטוף כמה פעמים עם המדיום EGTA ללא בשימוש בתוך השעות הראשונות לאחר בידוד.

preparation of highly coupled rat heart mitochondria

הפונקציה של המיטוכונדריה בדור הסלולר של ה-ATP בתהליך של זרחון חמצוני זוכה להכרה רחבה. במהלך העשורים האחרונים חלו התקדמות משמעותית להבנתנו את הפונקציות של אחרים במיטוכונדריה מאשר הדור של אנרגיה. אלה כוללים את תפקידם אפופטוזיס, מתנהג כמו איתות האברונים, פיתוח יונקים ההזדקנות, כמו גם תרומתם תיאום בין מטבוליזם התא ובחלוקה של תאים. ההבנה שלנו של תהליכים ביולוגיים מווסתת על ידי המיטוכונדריה מבוסס על שיטות חזקים בידוד וטיפול של המיטוכונדריה שלם מרקמות של חיות מעבדה. המיטוכונדריה מהלב עכברוש הוא אחד הנפוצים ביותר ההכנות ללימודים בעבר ובהווה של חילוף חומרים התאי, כולל מחקרים על עקום החוצה וחיות. כאן אנו מתארים שיטה מהירה מפורט עבור בידוד של המיטוכונדריה שלם עם רמה גבוהה של צימוד. הכנה כזו של הלב חולדה המיטוכונדריה הוא אובייקט מצוין עבור מחקר תפקודית מבנית על bioenergetics הסלולר, הובלה של ביומולקולות, מחקרים proteomic וניתוח של דנ&quot;א, חלבונים ושומנים במיטוכונדריה.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria at JoVE.com

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

אנו מתארים פרוטוקול а עבור בידוד של לב טהור בשילוב עכברוש מאוד המיטוכונדריה ללימודי פונקציונליים או מבניים של bioenergetics הסלולר, מדידות biophysical, proteomics או הדנ&quot;א המיטוכונדרי וניתוח שומנים.

הכנה של הלב עכברוש מצמידים מאוד המיטוכונדריה

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Research

JoVE Journal

Biology

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

השתלת רקמות מהונדסות בלב החולדה

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

הכנת הגידים זנב עכברוש ללימודי biomechanical ו Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או<em&gt; בVivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

הכנת סרום העכברוש מתאים לתרבות עובר שלמה יונקים

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...