Name: profiling of pre-micro rnas and micrornas using quantitative real-time pcr (qpcr) arrays
Uploaded: 2010-12-03T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays at JoVE.com

<p class="jove_content"> Este trabalho foi financiado pelo NIH concede DE018304, R01DE018281. KT é apoiada por GM07092 T32-34 e por uma concessão para a University of North Carolina em Chapel Hill do Howard Hughes Medical Institute (HHMI) através do Med em Grad Initiative. PC é suportado pelo T32 CA009156. </p>

<p class="jove_content"> A qPCR arrays pré-miRNA perfil pode ser configurado como totalmente automatizada com uma liberdade Tecan Evo robô (A) ou à mão com a pipeta multicanal Matrix eletrônico (B). </p><p class="jove_title"> 1) Prepare a mistura principal, placas primer e amostras. </p><ol><li> Primer placas contendo 186 pares de primers em formato de 96 poços (total de 2 placas) em 12:05 devem ser armazenadas a -80 ° C. Placas descongelar em temperatura ambiente, vortex e centrifugar brevemente antes de usar. </li><li> Para preparar o ...

<ol>
	<li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> <em style='font-style: italic'>Clinical Chem</em>. <b>55</b> (4), 611-622 (2009).</li><li>Fr&#233;geau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention.">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> <em style='font-style: italic'>J. Forensic Sci</em>. <b>53</b> (3), 53-533 (2008).</li><li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma.">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> <em style='font-style: italic'>PLoS Pathog</em>. <b>5</b> (4), e1000389-e1000389 (2009).</li></ol>

<p class="jove_content"> QPCR é um método altamente sensível que pode ser usado para comparar os níveis de expressão gênica entre as amostras em estudo, bem como para determinar a positividade no caso de vírus. A vantagem de usar arrays qPCR é a capacidade de executar muitos primers (no nosso caso, 186 pares de primers) para cada amostra em um curto período de tempo. Usando um robô de pipetagem, como o Freedom Tecan Evo, a quantidade de tempo necessário para definir um experimento up ainda pode ser reduzido, ea precisão ea consistê...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Freedom Evo 150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan</td>
<td>30017587</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrix Electronic Multichannel Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>2001-MTX</td>
<td>(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrix Integrity Filter Tips, Sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7435</td>
<td>(or comparable tip for multichannel used)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04 707 516 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Instrument II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05015243001</td>
<td>384-well version</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729749001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729757001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05075122001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eliminase Decontaminant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Decon Laboratories</td>
<td>04-355-31</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

profiling of pre-micro rnas and micrornas using quantitative real-time pcr (qpcr) arrays

<p class="jove_content">Quantitativas PCR em tempo real (qPCR) surgiu como uma ferramenta precisa e valiosa em perfis níveis de expressão de genes. Uma de suas muitas vantagens é um limite inferior de detecção em comparação com outros métodos de perfil de expressão gênica durante o uso de quantidades menores de entrada para cada ensaio. QPCR configuração automatizada tem melhorado neste campo, permitindo maior reprodutibilidade. Sua configuração conveniente e rápida permite high-throughput experimentos, permitindo a caracterização de muitos genes diferentes simultaneamente em cada experimento. Este método, juntamente com os controles internos da placa também reduz variáveis ​​experimentais comuns a outras técnicas. Recentemente, desenvolveu um ensaio de qPCR para o perfil de pré-microRNAs (pré-miRNAs), utilizando um conjunto de 186 pares de primers. MicroRNAs surgiram como uma nova classe de pequenos RNAs não-codificadores com a capacidade de regular as metas mRNA muitos ao nível pós-transcricional. Estes pequenos RNAs são transcritos primeiro pela RNA polimerase II como um miRNA primário (pri-miRNA) transcrição, que é então clivada para o miRNA precursor (pré-miRNA). Pré-miRNAs são exportados para o citoplasma, onde Dicer cliva o loop de hairpin para produzir miRNAs maduros. Aumento dos níveis de miRNA pode ser observado em ambas as precursor do miRNA maduro e níveis e perfis de ambas as formas podem ser úteis. Existem vários testes disponíveis comercialmente para miRNAs maduros, no entanto, seu alto custo pode dissuadir os pesquisadores a partir dessa técnica de perfil. Aqui, discutimos um custo-benefício, confiança, método qPCR SYBR baseada em perfis pré-miRNAs. Mudanças nos níveis pré-miRNA muitas vezes refletir as mudanças miRNA maduro e pode ser um indicador útil de expressão de miRNA maduro. No entanto, o perfil simultânea de ambos os pré-miRNAs e miRNAs maduros pode ser ótimo como eles podem contribuir com informações não redundantes e fornecer informações sobre processamento de microRNA. Além disso, a técnica descrita aqui pode ser expandido para englobar a caracterização de conjuntos de outra biblioteca para vias específicas ou patógenos.</p>

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Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

<p class="jove_content">Vamos demonstrar a configuração e análise de microRNA pré-96 também matrizes para QPCR usando um robô, bem como à mão com uma pipeta multicanal Thermo Scientific Matrix.</p>

Perfil dos pré-micro RNAs e microRNAs usando Quantitative PCR em tempo real (qPCR) Arrays

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Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

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