Name: profiling of pre-micro rnas and micrornas using quantitative real-time pcr (qpcr) arrays
Uploaded: 2010-12-03T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays at JoVE.com

<p class="jove_content"> Detta arbete stöddes av NIH bidrag DE018304, R01DE018281. KT stöds av T32 GM07092-34 och genom ett stipendium till University of North Carolina i Chapel Hill från Howard Hughes Medical Institute (HHMI) genom Med i Grad Initiative. PC stöds av T32 CA009156. </p>

<p class="jove_content"> Den qPCR före miRNA profilering arrayer kan sättas upp som helt automatiserad med en Tecan Freedom Evo robot (A) eller för hand med Matrix elektroniska multikanalpipett (B). </p><p class="jove_title"> 1) Förbered Master Mix, primer tallrikar och prover. </p><ol><li> Primer plattor innehåller 186 primerpar i 96-bra format (totalt 2 plattor) vid 12:05 bör förvaras vid -80 ° C. Tina plattorna i rumstemperatur, virvel och centrifugera kort före användning. </li><li> För att förbereda Master Mix, tina upp SYBR Gr...

<ol>
	<li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> <em style='font-style: italic'>Clinical Chem</em>. <b>55</b> (4), 611-622 (2009).</li><li>Fr&#233;geau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention.">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> <em style='font-style: italic'>J. Forensic Sci</em>. <b>53</b> (3), 53-533 (2008).</li><li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma.">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> <em style='font-style: italic'>PLoS Pathog</em>. <b>5</b> (4), e1000389-e1000389 (2009).</li></ol>

<p class="jove_content"> QPCR är en mycket känslig analysmetod som kan användas för att jämföra nivåer genuttryck mellan proverna i en studie, samt att bestämma positivitet i händelse av virus. Fördelen med att använda qPCR matriser är möjligheten att köra många primers (i vårt fall, 186 primerpar) för varje prov i en kort tid. Med hjälp av en pipett robot som Tecan Frihet Evo, den tid som krävs för att ställa ett experiment upp kan minskas ytterligare, och noggrannheten och konsekvensen i roboten kan minska och eliminera p...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Freedom Evo 150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan</td>
<td>30017587</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrix Electronic Multichannel Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>2001-MTX</td>
<td>(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrix Integrity Filter Tips, Sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7435</td>
<td>(or comparable tip for multichannel used)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04 707 516 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Instrument II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05015243001</td>
<td>384-well version</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729749001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729757001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05075122001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eliminase Decontaminant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Decon Laboratories</td>
<td>04-355-31</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

profiling of pre-micro rnas and micrornas using quantitative real-time pcr (qpcr) arrays

<p class="jove_content">Kvantitativa realtids-PCR (QPCR) har framträtt som en korrekt och värdefullt verktyg i profileringen nivåer genuttryck. En av dess många fördelar är en lägre detektionsgräns jämfört med andra metoder för profilering av genuttryck när du använder mindre mängder av input för varje analys. Automatiserad qPCR inställning har förbättrats detta område genom att medge mer reproducerbarhet. Det bekväma och snabb installation möjliggör hög genomströmning experiment, vilket gör att profilering av många olika gener samtidigt i varje försök. Denna metod tillsammans med invändig plåt kontroller minskar också experimentella variabler gemensamma för andra tekniker. Vi nyligen utvecklat en qPCR assay för profilering av pre-mikroRNA (pre-miRNA) med en uppsättning av 186 primerpar. MikroRNA har uppstått som en ny klass av små icke-kodande RNA med möjlighet att reglera många mRNA mål på efter transkriptionella nivå. Dessa små RNA är först transkriberas av RNA-polymeras II som en primär miRNA (pri-miRNA) avskrift, som sedan klyvs i föregångaren miRNA (pre-miRNA). Pre-miRNA exporteras till cytoplasman där Dicer klyver hårnål slingan för att ge mogna miRNA. Ökningar av miRNA nivåer kan ses på både föregångare och mogna nivåer miRNA och profilering av båda dessa former kan vara användbart. Det finns flera kommersiellt tillgängliga analysmetoder för mogna miRNA, men kan deras höga kostnader avskräcker forskare från denna profilering teknik. Här diskuterar vi en kostnadseffektiv, pålitlig, SYBR baserad qPCR metod för profilering pre-miRNA. Förändringar i pre-miRNA avspeglar ofta mogna miRNA förändringar och kan vara en värdefull indikator på mogna miRNA uttryck. Däremot kan samtidig profilering av både pre-miRNA och mogna miRNA vara optimal eftersom de kan bidra nonredundant information och ge insikt i mikroRNA bearbetning. Dessutom kan den teknik som beskrivs här att utökas till att omfatta profilering av andra bibliotek satser för specifika vägar eller patogener.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays at JoVE.com

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

<p class="jove_content">Vi kommer att visa installationen och analys av pre-mikroRNA 96-bra arrayer för QPCR med hjälp av en robot och för hand med en Thermo Scientific Matrix multikanalpipett.</p>

Profilering av Pre-mikro-RNA och mikroRNA hjälp av kvantitativ realtids-PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Kvantitativa realtids-PCR med Thermo Scientific Solaris qPCR analys

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (<em>Agrilus planipennis</em>) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Analys av genuttryck i Emerald Ash tillväxtborr (<em> Agrilus planipennis</em>) Med kvantitativa realtid-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Determining Genetic Expression Profiles in <em>C. elegans</em> Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Fastställande genuttryck profiler i<em> C. elegans</em> Använda Microarray och Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Kvantitativ Real-time Analysis of Base excision reparation aktivitet i cellysat Produkten bygger på sårspecifik Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilering individuella mänskliga embryonala stamceller genom kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Realtid Mätningar av membranprotein: Receptor interaktioner Använda Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-baserade Real-time PCR Approaches för kvantitativ mätning av mikroRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analys - En hög genomströmning, Realtid PCR-analys för Sc2.0 Genotypning

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Absolut kvantifiering av mikroRNA plasmanivåer hos Cynomolgus-apor använder kvantitativ realtids omvänd Transkription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Realtidsövervakning av aurorakinas en aktivering med konformationella FRET-biosensorer i levande celler

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...