Name: protocol for plasmodium falciparum infections in mosquitoes and infection phenotype determination
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination at JoVE.com

א הכנת תרבות gametocyte: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו דם אדם טרי בסרום עד 37 מעלות צלסיוס בתוך אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף קטר, בתנאים סטריליים, pipet 1 מ&quot;ל של דם חם לתוך צינור Eppendorf. ספין הדם בצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 2200 סל&quot;ד. אריתרוציטים יש pelleted, להסיר ולסלק את הנסיוב ברור. לשטוף erythocytes עם נפח שווה של חדש 3 פעמים כדי לקבל נסיוב הדם כולו gametocytes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את התרבות gametocyte מן CO 2 באינקובטור או צנצנת נר. תרבות זו יש לשמור על RPMI התקשורת נמאס היתושים ביום 16 של התרבות. כדי לקבוע את% gametocytemia (ביום 16 של התרבות) להפוך את כתם דק בשקופית זכוכית עם דם טיפה אחת ולבצע Geimsa כתם. לקבוע את מספר הגמטות בשדה התרבות הטפיל. זה בדרך כלל בטווח של 2-4%. חשב את נפח הדם כולו כי תצטרך להשיג את הרצוי gametocytemia% הסופית (0.3 -1%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביותר של התקשורת מתרבות gametocyte שלך ​​באמצעות pipet, נזהרת שלא להפריע או למצוץ את הטפילים (פרזיטים יופיעו שחור בעוד התקשורת יהיה ורוד בהיר / אדום). Pipet את שאר כלי התקשורת וטפילים לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל בז. ספין בצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 2200 סל&quot;ד. טפילים ו אריתרוציטים גלולה יהיה, להסיר ולסלק התקשורת supernatant ללא טפילים מטרידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב טפילים עם נפח הדם כולו מוכן (מ A2 צעד) לתת לך את gametocytemia הסופי הרצוי על פי חישובים קודמים. Pipet לערבב היטב. (~ 1 דקה) </li></ol> זהו עכשיו המדגם תוכלו להאכיל את היתושים שלך. שמור על 37 מעלות צלזיוס באמבט של מים. ב יתושים האכלה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים יתושים אנופלס שלך (~ 30-50) לתוך שעווה מצופה כוסות קרטון מכוסה רשת רשת מאובטחת על ידי גומייה או מכסה קרטון מסופק עם כוס. אנו משתמשים aspirator המופעל באמצעות סוללה נטענת עבור שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את זרימת המים באמבט ידי הוספת חרירי משני צדי ניזונים זכוכית צינור גומי. חבר כמו ניזונים רבות ככל שאתה צריך בסדרה: קצה אחד של הסדרה צריך להיות שמחוברות בצינור circulator האמבט במים (החלק דוחף מים דרך ניזונים), את הקצה השני של הסדרה צריכה להיות מורכבת צינורות גומי שקוע באמבטיה כדי לאפשר את המים שהופץ לרוקן לתוך אמבטיה. הפעל את האמבטיה במים עד כ 37 מעלות צלסיוס ומים הוא מחזורי דרך ניזונים וחזרה לאמבטיה. זה חיוני כדי לשמור על חם הדם ולשמור פרזיטים בחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הממברנה (אנו משתמשים ריבועים קטנים של parafilm נמתח) על ידי מתיחת סביב מזין את הממברנה זכוכית, תוך שימוש בלחץ לאטום בחוזקה פתיחת מזין. קרום זה יהיה לחקות את העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד מזין קרום בצד למטה על כל כוס יתושים ניזונים מאובטח באמצעות מלחציים או קלטת. הממברנה צריך לשבת מיושר עם הרשת כך יתושים יכול לגשת אליו מבפנים הגביע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות פיפטה טפיל דם ארוחה (מ A5 צעד) לתוך צווארו של מזין, מוודא דם הולך כל הדרך דרך הצוואר אל תוך המאגר, פנייה קרום כך היתושים יכולים לגשת דם. אנו משתמשים על 200 μl של דם לכל מזין, אבל זה יכול להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להאכיל את היתושים. אנו מאפשרים להם להאכיל עבור ≈ 30 דקות (משתנה, בהתאם theexperiment, כי רוב הניסויים, לעתים ניטור כמה כבר עברו ארוחה מלהסתכל תוכן הדם בחלל הבטן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר האכלה, להסיר ניזונים מן כוסות יתושים. כבה את האמבטיה במים לנתק ניזונים מן צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קרום ולספוג ניזונים ב אקונומיקה 10% לטהר ולשטוף עם מים. המקום מזוהם החומר (ממברנות, מגבות נייר, כפפות, וכו &#39;) לתוך שקית פיקדון Biohazard קטן ב קיבול Biohazard גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי יתושים על ידי הצבת כוסות במקרר או בחדר קר. לאחר יתושים מורדמים לגמרי, להעביר אותם על צלחת פטרי מוטבע בתוך דלי קרח. יתושים מיין, והביטה בזהירות אל הבטן לכל סימן של ארוחה הדם, וזורקים אותם כי לא להאכיל. יתושים חלקם יהיו צבה מלא בעוד שאחרים יציגו רצועה צרה של דם בלע; כל מקובלות כמו &quot;נמאס&quot;. שים את היתושים נמאס חזרה לתוך כוסות קרטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק ארוחה סוכר (פיסת צמר גפן טבול סוכרוז 10%) על יתושים, ועל דגירה בתנאים insectary נורמלי למשך 7 ימים. כל יום, היתושים יש לעקוב לשיעור התמותה. בנוסף, הכותנה צריכה להיעשות רטוב עם סוכרוז, כך שהם אינם מקופחים של מזון. זה יותר טוב, ובכל זאת, כדי להוסיף מגבת נייר ספוגה במים מזוקקים, כדי לשמור על היתושים לח. יתושים אלה פ falcipraum נגוע, כך שכל הטיפול חייב להילקח כך יתושים לא יכול escapדואר מהספל. מומלץ לשים את כוסות הגנה cagefor קטן כפול. </li></ol> ג הביתור midguts יתוש והערכת המון oocyst: <ol style="margin-top: 0in;text-align:right;direction:rtl"><li style="tab-stops: list .5in;text-align:right;direction:rtl"> לשאוב יתושים (מ-B צעד) מן כוסות קרטון באמצעות aspirator המופעל באמצעות סוללה נטענת. הרדימי יתושים, אשר נמצאים בתוך המאגר aspirator נשלף, על ידי הזזת לחדר קר או לקבור את מאגר בקרח במשך לפחות 5 דקות או עד יתושים להפסיק לנוע. </li><li style="tab-stops: list .5in;text-align:right;direction:rtl"> העברת יתושים הרדים מן המאגר אל צלחת פטרי זכוכית מוטבע קרח. מורחים את היתושים כדי בשכבה אחת ומכסים במכסה פלסטיק צלחת פטרי. יתושים כי לא ניתן לאכלס על הצלחת להישאר המאגר, אשר חזר לחדר קר או קרח. </li><li style="tab-stops: list .5in;text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קנס שקצהו מלקחיים, העברת יתוש אחד מצלחת עד 100 ul PBS הכלול בשקופית זכוכית רכוב תחת מיקרוסקופ לנתיחה. השאירו את השאר מכוסה בצלחת פטרי צונן. </li><li style="tab-stops: list .5in;text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קנס שקצהו מלקחיים, החזק יתושים בבית החזה ואת הבטן האחורי. משוך את הגוף בנפרד עד midgut חשוף. שימוש במלקחיים כדי להסיר עודפי רקמה מהבטן gut.The נראה כמו לבן, דמויי גוף. הסרת רקמה עודפת מן gut.Mount המעיים אחד טוב של שקופית 12-היטב זכוכית לטבול μl 5-10 של 0.2% יוד. סקווש נבלת וזורקים על towel.Continue נייר לחה יתושים אחרים, עד 12 שקופיות גם מלא. מכסים את האומץ רכוב עם coverslip זכוכית. </li><li style="tab-stops: list .5in;text-align:right;direction:rtl"> בדוק אומץ תחת מיקרוסקופ אור, מחפש שביצים עגול כתם ורוד בהיר נגד רקמת ברור / חלש המעיים ורוד. הרוזן שביצים, שיא ולהמשיך מדגם הבאה. המשך לכל היתושים מכל טיפולים ניסיוניים. </li><li style="tab-stops: list .5in;text-align:right;direction:rtl"> בסיום, למחוק שקופיות לנקות עם מגבת נייר. מניחים את מגבת נייר עם אומץ, וגם מגבת נייר עם פגרים, לשקית Biohazard קטן וזורקים לפח. כפפות שחוקים לאורך ההליך. הטיפול נלקח לא לתת כל לברוח יתושים נגועים. </li></ol>

<ol>
	<li>Avila, S. L., Ferreira, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+diagnosis:+a+review.">Malaria diagnosis: a review.</a> Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).</li><li>Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+PCR+assay+for+quantifying+Plasmodium+falciparum+infections+in+the+mosquito+vector.">A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector.</a> Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).</li><li>Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Plasmodium+malariae+infection+in+mosquito+vectors.">Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors.</a> Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).</li><li>Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISA+study+of+oocyst-sporozoite+transition+in+malaria+vectors.">ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors.</a> Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).</li><li>Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+the+results+of+light+microscopy+with+the+results+of+PCR+method+in+the+diagnosis+of+Plasmodium+vivax.">Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax.</a> J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).</li><li>Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-step,+PCR-based+method+for+the+detection+and+differentiation+of+Plasmodium+vivax.">A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax.</a> Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).</li><li>Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mosquito+genes+on+Plasmodium+development.">Effects of mosquito genes on Plasmodium development.</a> Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).</li><li>Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Plasmodium+and+Anopheles+transcriptomes+during+oocyst+differentiation.">Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).</li></ol>

לא יכול להיות כמה וריאציות הזיהום Plasmodium לבין פנוטיפ נחישות זיהום מעבדות שונות עשוי לעקוב בטכניקות שונות.

protocol for plasmodium falciparum infections in mosquitoes and infection phenotype determination

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאלי עבור מלריה, זה חייב להיות מוערך על תפקידה במניעת זיהומים Plasmodium בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים Plasmodium של יתושים יכול להיות assayed. טכניקות להכנת תרבות gametocyte, האכלה קרום יתושים דם האדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination at JoVE.com

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

פרוטוקול זיהומים Plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

פרוטוקול זיהומים דנגי ב יתושים (א aegypti) ו הפנוטיפ קביעת זיהום

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

פרוטוקול וידאו של זיהום retroviral ביסודי מעיים Organoid תרבות

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

שעון סריקה פרוטוקול ניתוח תמונה: Plugins ImageJ

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

פרוטוקול עבור המעבדה דיור של טורקיז דגים גמבוזיים (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

זיהום חיידקי הפה ו Shedding ב דרוזופילה melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...