Name: visualization of uv-induced replication intermediates in e. coli using two-dimensional agarose-gel analysis
Uploaded: 2010-12-21T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis at JoVE.com

हमारी प्रयोगशाला में कार्य राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन और NIGMS NIH से क्षेत्र R15GM86839 अनुदान से रोजगार MCB0551798 पुरस्कार द्वारा समर्थित है.

1. ग्रोथ और यूवी किरणन. <ol><li> 200μl एक ताजा रातोंरात प्लाज्मिड pBR322 डेविस 1 मध्यम में बड़े 0.4% ग्लूकोज, 0.2% casamino एसिड, और 10 / μg मिलीलीटर थिमाइन (DGCthy मध्यम) और 100 μg / मिलीलीटर एम्पीसिलीन के साथ पूरक युक्त संस्कृति के pelleted ?...

<ol>
	<li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin.">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li><li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli.">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li><li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis.">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li><li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences.">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning - A laboratory manual. , (2001).</li><li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli.">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li><li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli.">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li><li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli.">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li><li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork:+a+comparison+to+UV-induced+arrest.">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li><li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecBCD+and+RecJ/RecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli.">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li><li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions.">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li></ol>

विशिष्ट उपस्थिति और यूवी प्रेरित क्षति के अभाव में जंगली प्रकार की कोशिकाओं से प्राप्त परिणामों चित्र 1 में दिखाया जाता है. क्षति के अभाव में, कुल प्लास्मिड डीएनए का ~ 1% Y चाप में पाया जा सकता है जब कोशिका?...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>An example of the Southern analysis of the 2D gel probed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE</td>
<td>G15T8</td>
<td>Yellow Lighting</td>
</tr>
<tr>
<td>15 &mu;watt germicidal lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sylvania</td>
<td>F20T12/GO</td>
<td>UV Lamp</td>
</tr>
<tr>
<td>Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Daigger</td>
<td>EF28195T</td>
<td>UVC photometer</td>
</tr>
<tr>
<td>0.025 &mu;m pore disks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>VSWP04700</td>
<td>Floating dialysis disks</td>
</tr>
<tr>
<td>PvuII</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>ER0632</td>
<td>Restriction Endonuclease</td>
</tr>
<tr>
<td>Nick-translation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>976776</td>
<td>To make 32P-labeled probe</td>
</tr>
<tr>
<td>Blotting Paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>3030-704</td>
<td>For Southern transfer</td>
</tr>
<tr>
<td>Nylon membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>RPN203S</td>
<td>For Southern transfer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of uv-induced replication intermediates in e. coli using two-dimensional agarose-gel analysis

डीएनए की क्षति की उपस्थिति में गलत प्रतिकृति सेलुलर rearrangements और mutagenesis के सभी प्रकार की कोशिकाओं में मनाया और व्यापक रूप से मनुष्यों में कैंसर के विकास के साथ सीधे जुड़े होने का विश्वास के बहुमत के लिए जिम्मेदार है. यूवी विकिरण से प्रेरित के रूप में डीएनए की क्षति, गंभीर जीनोमिक टेम्पलेट सही नकली प्रतिकृति की क्षमता impairs. जीन उत्पादों की एक संख्या की पहचान की गई है कि जब प्रतिकृति टेम्पलेट में डीएनए घावों मुठभेड़ों आवश्यक हैं. हालांकि, एक शेष चुनौती प्रतिकृति के दौरान इन प्रोटीनों कैसे प्रक्रिया घावों का निर्धारण किया गया है<em&gt; Vivo में</em&gt;. एक मॉडल प्रणाली के रूप में Escherichia कोलाई का उपयोग, हम एक प्रक्रिया है जिसमें दो आयामी विश्लेषण agarose जेल संरचनात्मक मध्यवर्ती है कि नकल plasmids पर उठता पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णन<em&gt; Vivo में</em&gt; यूवी प्रेरित डीएनए की क्षति के बाद. इस प्रक्रिया को दिखाना है कि प्रतिकृति कांटे यूवी प्रेरित नुकसान से अवरुद्ध है कि RecA और कई RecF मार्ग के साथ जुड़े जीन उत्पादों के द्वारा स्थिर है एक क्षणिक उत्क्रमण से गुजरना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. तकनीक दर्शाता है कि इन प्रतिकृति मध्यवर्ती एक समय है कि nucleotide काटना की मरम्मत और प्रतिकृति शुरू द्वारा घावों को हटाने के साथ संबद्ध जब तक रखा जाता है.

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Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

हम एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा दो आयामी विश्लेषण agarose जेल प्रतिकृति मध्यवर्ती कि यूवी विकिरण के बाद होते हैं की संरचना को पहचानने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्तमान.

यूवी प्रेरित प्रतिकृति मध्यवर्ती के दृश्य ई. कोलाई दो आयामी agarose जेल विश्लेषण का उपयोग

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

प्लास्मिड डीएनए के ई. कोलाई में परिवर्तन हीट शॉक विधि का प्रयोग

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

तंत्रिका स्टेम सेल गतिशीलता का मूल्यांकन एक agarose जेल आधारित microfluidic युक्ति का प्रयोग

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

अर्ध denaturing डिटर्जेंट - agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा Amyloid एकत्रीकरण के लिए स्क्रीनिंग

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis और कार्यात्मक निर्देशित प्रोटीन में एवोल्यूशन के लिए चयन प्रोटोकॉल ई. कोलाई</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

डीएनए प्रतिकृति के विज़ुअलाइज़ेशन हड्डीवाला मॉडल प्रणाली DT40 में डीएनए फाइबर तकनीक का उपयोग

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

डीएनए टुकड़े के पृथक्करण के लिए agarose जेल वैद्युतकणसंचलन

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

बाल उत्थान के दौरान तेजी से उपकला-mesenchymal संकेतन की आनुवांशिक विश्लेषण

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

प्रतिदीप्ति का प्रयोग mRNA अणुओं के दृश्य और विश्लेषण<em&gt; स्वस्थानी</emमें&gt; संकरण<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

लक्षित sRNA के फेज की मध्यस्थता प्रसव में जीन की अभिव्यक्ति नीचे दस्तक करने के निर्माणों<em&gt; ई। कोलाई</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

में मानव Norovirus फैला हुआ डोमेन का उत्पादन<em&gt; ई। कोलाई</em&gt; एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...