Name: visualization of uv-induced replication intermediates in e. coli using two-dimensional agarose-gel analysis
Uploaded: 2010-12-21T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis at JoVE.com

Работа в нашей лаборатории проводится при поддержке КАРЬЕРА награду MCB0551798 от Национального научного фонда и грант ОБЛАСТЬ R15GM86839 от NIGMS-NIH.

1. Рост и УФ-облучения. <ol><li> 200 мкл свежей ночной культуры содержащие плазмиды pBR322 выросли в Дэвисе среду 1 дополнена с 0,4% глюкозы, 0,2% casamino кислоты и 10 мкг / мл тимин (DGCthy среды) и 100 мкг / мл ампициллина является гранулированный. Осадок клеток, затем ресуспендировали в 200 мкл среды DGCthy ?...

<ol>
	<li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin.">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li><li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli.">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li><li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis.">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li><li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences.">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning - A laboratory manual. , (2001).</li><li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli.">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li><li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli.">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li><li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli.">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li><li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork:+a+comparison+to+UV-induced+arrest.">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li><li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecBCD+and+RecJ/RecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli.">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li><li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions.">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li></ol>

Типичные результаты, полученные от дикого типа клетки в присутствии и в отсутствие УФ-индуцированного повреждения показаны на рисунке 1. При отсутствии повреждений, ~ 1% от общей плазмидной ДНК можно найти в дуге Y, когда клетки быстро растут в экспоненциальной фазе. После облучения, прех...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>An example of the Southern analysis of the 2D gel probed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE</td>
<td>G15T8</td>
<td>Yellow Lighting</td>
</tr>
<tr>
<td>15 &mu;watt germicidal lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sylvania</td>
<td>F20T12/GO</td>
<td>UV Lamp</td>
</tr>
<tr>
<td>Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Daigger</td>
<td>EF28195T</td>
<td>UVC photometer</td>
</tr>
<tr>
<td>0.025 &mu;m pore disks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>VSWP04700</td>
<td>Floating dialysis disks</td>
</tr>
<tr>
<td>PvuII</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>ER0632</td>
<td>Restriction Endonuclease</td>
</tr>
<tr>
<td>Nick-translation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>976776</td>
<td>To make 32P-labeled probe</td>
</tr>
<tr>
<td>Blotting Paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>3030-704</td>
<td>For Southern transfer</td>
</tr>
<tr>
<td>Nylon membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>RPN203S</td>
<td>For Southern transfer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of uv-induced replication intermediates in e. coli using two-dimensional agarose-gel analysis

Неточный репликации в присутствии ДНК является причиной большинства сотовых перестановок и мутагенеза наблюдается во всех типах клеток, и многие считают, непосредственно связанные с развитием рака у людей. Повреждение ДНК, как, например, индуцированной УФ-излучением, сильно снижает способность репликации дублировать геномной шаблон точно. Ряд продуктов генов были идентифицированы, которые необходимы при репликации встреч повреждений ДНК в шаблоне. Тем не менее, остающиеся проблемы в том, чтобы определить, как эти повреждения белков процесс во время репликации<em&gt; В естественных условиях</em&gt;. Использование кишечной палочки в качестве модельной системы, мы опишем процедуру, в которой двумерная агарозном гель-анализ может быть использован для выявления структурных промежуточных, которые возникают на репликацию плазмид<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Следующий УФ-индуцированного повреждения ДНК. Эта процедура была использована, чтобы продемонстрировать, что репликация вилки заблокирован УФ-индуцированного повреждения пройти переходный разворота, которая стабилизируется RecA и нескольких продуктов гена, связанного с пути RecF. Техника показывает, что эти промежуточные репликации, сохраняются до времени, что коррелирует с удалением от поражения нуклеотидных репарации и репликации возобновляется.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis at JoVE.com

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Мы представляем процедура, посредством которой двумерной агарозном гель-анализ может быть использован для определения структуры репликации промежуточных, которые происходят следующие УФ-облучения.

Визуализация УФ-индуцированной репликации промежуточных Е. палочки Использование двумерных агарозном гель-анализа

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Преобразование плазмидной ДНК в E.coli, с использованием метода теплового шока

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Оценка подвижности нейронных стволовых клеток Использование агарозном геле основе микрожидкостных устройств

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Скрининг на агрегации амилоида по Полу-денатурирующих моюще-электрофореза в агарозном геле

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Мутагенеза и функциональные Выбор протоколов для направленной эволюции белков в Е. палочки</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Визуализация репликации ДНК в позвоночных DT40 Модель системы с использованием техники ДНК-волоконной

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Агарозном геле для разделения фрагментов ДНК

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Быстрое Генетический анализ эпителиальных мезенхимальных сигнализации во время регенерации волос

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Фаг-опосредованной доставки целевых рРНК Создаёт к нокдауна экспрессии генов в<em&gt; E. палочки</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Производство человека Norovirus выступающую Домены в<em&gt; E. палочки</em&gt; Для рентгеновской кристаллографии

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...