Name: feeder-free adaptation, culture and passaging of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00
Duration: 8 min 29 s
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참고 : 무균 문화 조건을 유지하기 위해서는이 프로토콜의 절차를 모두 무균 실험실 방법을 사용하여 수행하고 층류 후드 아래에 실시하고 있습니다. 시작하기 전에, 모든 미디어는 37 equilibrated되도록 ° C 적절하게 기름. Geltrex - 코팅 문화 요리를 준비 참고 : CELLstart 코팅 문화 요리의 사용을 위해 부록을 참조하십시오 <ol><li> 해동 한 천천히 2-8에서 Geltrex (1 ML) ° C의 튜브 및 넉아웃 D-MEM/F-12 99 ML에 1:100 그것을 희석. 부드럽게 솔루션을 섞는다. 참고 : 일부 IPS 세포 라인은 최적의 성장을 위해 다른 Geltrex 희석이 필요할 수 있습니다. 대체 dilutions에 대한 부록을 참조하십시오. </li><li> Geltrex 솔루션 (35 - mm 요리 1 ML, 60 mm 요리 1.5 ML) 각 문화 요리의 전체 표면을 커버. </li><li> 건조를 방지하고 37에서 1 시간 동안 요리를 부화 Parafilm 각 접시 ° C. 봉쇄해 참고 : 최대 1 개월이 지점에서 4 ° C에서 Geltrex - 코팅 문화 요리를 저장할 수 있습니다. 밖으로 건조에서 Geltrex을 방지하기 위해 Parafilm 각 요리를 밀봉합니다. </li><li> 이전 사용하기 층류 후드에 Geltrex - 코팅 요리를 전송하고는 실온 (약 1 시간)에 평형 수 있습니다. </li></ol> 완료 녹아웃의 SR 공급기 - 무료 매체를 준비 <ol><li> 10 μg / ML 기본 FGF 솔루션 1 ML를 준비하려면, 무균 아래에 나열된 구성 요소를 섞는다. -20 ° C에서 나누어지는 솔루션 및 저장 최대 6 개월까지. <table border="0"><tbody><tr><td> 기본 FGF </td><td> 10 μg </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 990 μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 μL </td></tr></tbody></table> 참고 : BSA는 같은 농도에서 HSA 또는 넉아웃의 SR로 대체 수 있습니다. </li><li> 2 MG / ML Dispase 솔루션의 50 ML를 준비하려면, 무균 아래에 나열된 구성 요소를 섞는다. 4 솔루션 및 저장 ° C 최대 2 주 동안을 소독 필터. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 MG </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 50 ML </td></tr></tbody></table></li><li> 전체 녹아웃의 SR 피더 - 무료 (KSR - FF) 매체 무균 아래 표에 나와있는 구성 요소를 결합 100 ML를 준비합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 주식 농도 </td><td> 최종 농도 </td><td> 음량 </td></tr><tr><td> 마네 DMEM/F12 (Cat. 번호. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 ML </td></tr><tr><td> GlutaMAX - I (Cat. 번호 35050-061) </td><td> 200 MM </td><td> 2 MM </td><td> 1 ML </td></tr><tr><td> 녹아웃 SR (Cat. 번호. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 ML </td></tr><tr><td> 녹아웃 SR - GFC (Cat. 번호. A10580 - 01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td> bFGF (Cat. 번호. PHG0024) </td><td> 10 μg / ML </td><td> 20 NG / ML </td><td> 200 μL </td></tr></tbody></table> 최대 일주일을 위해 당신은 2-8 ° C에서 KSR - FF 매체를 저장할 수 있습니다. </li><li> 온도와 가스의 전체 매체를 미리 equilibrating 바로 전에 무균 0.1 MM 최종 농도 2 메르 캅 토 에탄올의 필요한 볼륨 (55 MM 주식 농도)을 추가합니다. 예를 들어, KSR - FF 매체의 100 ML를 준비하는 것은 2 - 메르 캅 토 에탄올 (1:550 희석) 또는 55 mm의 182 μL를 추가, 2 - 메르 캅 토 에탄올이에 대한 1X 완료 매체에 추가 2-8 ° C에서 저장될 수 있습니다 최대 일주일. </li></ol> KSR - FF 중간에 iPSCs를 적응 <ol><li> 시작하기 전에, 후드에서 상온에 Geltrex 코팅 요리를 미리 평형. </li><li> 문화 MEF 피더 세포에서 iPSCs 그들은 70-80%의 합류 때까지. MEF 기반 문화 프로토콜에 대한 GIBCO 마우스 배아의 Fibroblast 수첩을 참조하십시오. </리&gt; <li> 37 ° C의 물을 욕조에 Dispase 사전 따뜻한 필요한 볼륨. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오. </li><li> 37 ° C의 물 목욕 for15 분에 KSR - FF의 필요한 볼륨을 사전에이 - 평형. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오. </li><li> 문화 요리에서 매체를 기음과 Dispase 솔루션의 적절한 금액을 추가합니다. 3~5분에 대해 37 ° C에서 요리를 품다. </li><li> 각 문화 선박에서 Dispase 솔루션을 기음과 D - PBS (2 3 회)로 부드럽게 MEF의 피더 세포를 씻어. </li><li> 각 문화 선박을 완료 마네의 SR 매체의 적절한 금액을 추가합니다. 부드럽게 문화 선박의 표면에서 세포를 긁어 셀 스크레이퍼 또는 5 ML의 피펫을 사용합니다. 참고 : 하드 IP를 적응 세포 라인에 대한 대체 적응 프로토콜에 대한 부록을 참조하십시오, </li><li> 별도의 15 ML 원뿔 튜브에 각 문화 접시에서 세포 현탁액를 수집합니다. 전체 녹아웃의 SR 매체의 적절한 금액을 각 문화 선박 린스, 그리고 D - PBS는 세포 현탁액을 포함 15 ML 원뿔 튜브로 매체를 씻어 추가합니다. 하나의 세포로 세포 대단히 짧은 시간을 휴식하지 않는주의 </li><li> 펠렛 iPSCs 5 분 200 XG에 15 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기. </li><li> iPSC 펠렛에서 뜨는을 대기음. 분할 비율 (표 1)에 따라 KSR - FF 매체의 적절한 금액 펠렛을 Resuspend. 작은 대단히 짧은 시간이 표면에 잘 부착하지 않기 때문에, 작은 크기로 휴대 대단히 짧은 시간을 아프게하지 마십시오. 참고 : iPSCs이 KSR - FF 매체에 iPSC MEF 문화 미디엄에서 직접 passaged 후에 우리는 처음 3 구절에 대한 1시 2분의 분할 비율을 권장합니다. 일반적으로 1시 3분과 1시 5분 사이의 분할 비율이 적합하지만, 1시 2분에서 passaging 것은 피더 무료 문화에 적응 할 때 필요한 세포의 높은 밀도를 보장합니다. </li><li> 이전 Geltrex 코팅 요리 iPSCs을 도금하는 사전 코팅 접시에서 잔여 Geltrex 솔루션을 기음, 천천히 각 문화 요리에 세포 현탁액의 적절한 금액을 추가합니다. 참고 : 도금하기 전에 요리를 씻어하지 않습니다. </li><li> 접시의 표면에 걸쳐 세포를 해산하는쪽으로 여러 번 앞뒤로 측면 문화 요리를 이동합니다. 부드럽게 공기 4-6%의 CO 2의 humidified 분위기 37 ° C 배양기에서 배양 접시를 놓습니다. KSR - FF로 보낸 매체 매일 교체합니다. </li></ol> KSR - FF을 사용하여 Passaging 인간의 IPS 세포 <ol start="13"><li> 세포 70-80% 합류하고 subcultured 준비가되었는지 확인하기 위해 현미경으로 전체 KSR - FF의 성장 인간 iPSCs을 준수. 1 그림을 참조하십시오. 참고 : 식민지가 너무 밀도 또는 너무 커질 경우, 증가 차별이 발생합니다. </li><li> 잘라와 문화를 passaging하기 전에 어떠한 차별 iPSC 식민지를 제거합니다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 Dispase 사전 따뜻한 필요한 볼륨. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오. </li><li> 37 ° C의 물 목욕 for15 분에 KSR - FF의 필요한 볼륨을 사전에이 - 평형. 필요한 볼륨에 대한 자세한 내용은 아래의 표 1을 참조하십시오. </li><li> 피펫을 사용하여 문화 선박에서 보낸 매체를 대기음하고, D - PBS로 두 번 세포를 씻어. </li><li> 부드럽게 문화 선박 (예, 60 mm 문화 요리 당 Dispase 솔루션 1 ML)로 사전 예열 Dispase 솔루션을 추가합니다. 코트 전체 세포 표면에 소용돌이 문화 우주선합니다. </li><li> 3 분 37 ° C에서 문화 함선을 품어. </li><li> 인큐베이터에서 혈관을 제거 Dispase 솔루션을 기음, 부드럽게 D - PBS로 세포를 씻어. </li><li> 부드럽게 세포 스크레이퍼를 사용하여 문화 접시의 표면에서 세포를 긁어 및 살균 15mL 원심 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 부드럽게 분리하지 않은 세포를 &quot;해제 분사.&quot;, KSR - FF로 두 번 문화 접시를 씻어 수영장은 15mL 튜브에 세포와 매체를 씻어. </li><li> 상온에서 펠릿 세포 5 분 200 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는를 대기음하고 폐기. </li><li> 부드럽게 튜브가 완전히 튜브 바닥에서 세포 펠렛을 이동시키다을 버려. </li><li> 부드럽게 5mL serological 피펫을 사용하여 사전 equilibrated KSR - FF의 세포를 resuspend. 씹다하지 마십시오. 참고 : 부드럽게 손상을 방지하기 위해 무력을 사용하지 않고 세포를 resuspend하는 단계에서 중요한 그것입니다. </li><li> 원하는 분할 비율에 신선한 60 mm Geltrex - 코팅 접시에 세포를 전송하고 표면을 가로질러 세포를 해산하는쪽으로 여러 번 앞뒤로 측면 문화 요리 이동합니다. </li><li> 의 humidified 분위기 37 ° C 배양기에서 배양 접시를 플레이스4~6%는 공중에 2 CO. </li><li> 그 다음날, 부드럽게 세포 파편을 제거하는 KSR - FF로 보낸 매체를 대체합니다. 이후 매일 지출 매체를 교체합니다. IPS 세포는 매일 그들로 (약 매 4~5일) 필요한 통로 관찰. Passaging은 세포가 70~80%의 합류에 도달했을 때 권장합니다. IPS 세포 cryopreservation 융해 들어, &quot;완료 마네 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 Cryopreserving 인적 IPS 세포 복구하기&quot;라는 제목의 프로토콜을 참조하십시오. </li></ol> 예상 결과 <img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 아래의 위상 콘트라스트 이미지는 완전 넉아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 Geltrex - 코팅 문화 요리에 성장 iPSCs를 보여줍니다. iPSCs 큰 핵 및 세포질 부족한 특징 hESCs에 형태학 유사한 나타냅니다. (40x 확대) <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 35mm 디시 </td><td> 60mm 디시 </td><td> 100mm 디시 </td></tr><tr valign="top"><td> 완료 녹아웃 SR 미디어 </td><td> 2 ML </td><td> 4 ML </td><td> 10 ML </td></tr><tr valign="top"><td> Geltrex 솔루션 </td><td> 1 ML </td><td> 1.5 ML </td><td> 4-5 ML </td></tr><tr valign="top"><td> Dispase </td><td> 0.5 ML </td><td> 1 ML </td><td> 3-4 ML </td></tr><tr valign="top"><td> rinsing을위한 D - PBS </td><td> 2 ML </td><td> 4 ML </td><td> 10 ML </td></tr></tbody></table> 표 1. 추천 볼륨 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">부록을 참조하려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li><li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li><li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons.">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li><li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Knockout DMEM/F12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. 12660-012</td>
<td>Note: see appendix for the use of alternative DMEM products</td>
</tr>
<tr>
<td>GlutaMAX-I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. No. 35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KnockOut SR, Cat. no. 10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FGF-basic, human recombinant protein, 10 &mu;g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>bFGF, Cat. no. PHG0024</td>
<td>Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.</td>
</tr>
<tr>
<td>2-Mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. 21985-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dispase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. 17105-041</td>
<td>Note: see appendix for alternative passaging methods.</td>
</tr>
<tr>
<td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. A10480-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. 14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Tissue Culture Hood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator set at 37&deg;C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette-Aid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water Bath set at 37&deg;C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60mm Tissue Culture treated dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

feeder-free adaptation, culture and passaging of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium

인간과 마우스 섬유아 세포가 배아 줄기 세포에 상당히 유사 자질을 가진 1-3 IPS 세포를 생성하는 재설정 될 수 있다고 2006 년에 발견은 약물 발견, 세포 치료와 기초 연구를위한 pluripotent 세포의 중요한 새로운 소스를 만들었습니다. GIBCO 미디어 및 시약 년 동안 pluripotent 줄기 세포 연구의 선두에있다. DMEM가 마네 세럼 교체와 보충 마네는 배아 줄기 세포의 성장과 지금은 IPS 세포 배양 3-9위한 최고의 매체입니다. 이 황금 표준 미디어 시스템은 이제 마네의 SR 성장 팩터 칵테일의 추가와 함께 피더 무료 문화 사용할 수 있습니다. 전통적인 인간의 ES와 IPS의 세포 배양 방법은 마우 스나 인간 fibroblast 피더 레이어의 사용 또는 피더 - 에어컨 매체를 필요로합니다. 이러한 문화 방법은 규모에 노동 집약, 하드 있으며, 그것은 정의되지 않은 상황으로 인해 undifferentiated 허리의 세포를 유지하기 어렵습니다. Invitrogen은 여전히​​ 마네의 SR의 사용을 유지하면서 당신이 피더 - 무료로 전환 엉덩이 셀 문화를 쉽게하도록 마네의 SR 성장 팩터 칵테일을 개발했습니다.

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Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

다음 프로토콜은 녹아웃 완료 세럼 교체 피더 - 프리 미디어 (KSR - FF)를 사용하여 피더 무료 문화 인간 유도 Pluripotent 줄기 (IPS) 셀을 적응을위한 지침을 제공합니다. 일단 지속적인 유지 보수를위한 지침도 제공되며, 적응.

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