Name: feeder-free adaptation, culture and passaging of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00
Duration: 8 min 29 s
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Nota: Para manter as condições de cultura estéril, todos os procedimentos neste protocolo são realizadas utilizando práticas de laboratório estéril e conduzidos sob uma capela de fluxo laminar. Antes de começar, certifique-se que qualquer mídia é equilibrado a 37 ° C e adequadamente gaseados. Preparar pratos Geltrex revestido Cultura Nota: ver anexo para o uso de placas de cultura de CELLstart revestido <ol><li> Tubo de descongelar um dos Geltrex (1 mL) lentamente a 2-8 ° C e diluir 1:100 em 99 mL de Knockout D-MEM/F-12. Misturar a solução suavemente. Nota: Algumas linhagens de células iPS podem requerer uma diluição Geltrex diferentes para o crescimento ideal. Veja o apêndice para diluições de alternativa. </li><li> Cobrir toda a superfície de cada placa de cultura com a solução Geltrex (1 mL para um prato de 35 mm, 1,5 mL para um prato de 60 mm). </li><li> Seal cada prato com Parafilm para evitar a secagem e incubar os pratos para 1 hora a 37 ° C. Nota: Neste ponto, você pode armazenar os pratos Geltrex revestido cultura a 4 ° C por até 1 mês. Seal cada prato com Parafilm para impedir a Geltrex sequem. </li><li> Antes de usar, transferir os pratos Geltrex revestido a uma capela de fluxo laminar e permitir-lhes atingir a temperatura ambiente (cerca de 1 hora). </li></ol> Preparando Alimentador-Free SR Completa KnockOut Médio <ol><li> Para preparar 1 mL de 10 mcg / ml solução FGF Basic, assepticamente misturar os componentes listados abaixo. Alíquota da solução e armazenar a -20 ° C por até 6 meses. <table border="0"><tbody><tr><td> FGF básico </td><td> 10 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990 mL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 L </td></tr></tbody></table> Nota: BSA pode ser substituído com HSA ou SR Knockout na mesma concentração. </li><li> Para preparar 50 mL de solução 2 Dispase mg / mL, assepticamente misturar os componentes listados abaixo. Filtro de esterilizar a solução e armazenar a 4 ° C por até duas semanas. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Para preparar 100 mL de SR KnockOut completa Alimentador-Free (KSR-FF) médio assepticamente combinar os componentes listados na tabela abaixo. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Concentração de ações </td><td> Concentração Final </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Knockout DMEM/F12 (Cat. n º. 12.660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76,8 mL </td></tr><tr><td> Glutamax-I (Cat. No. 35050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> KnockOut SR (sem Cat.. 10.828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> KnockOut SR-GFC (sem Cat.. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> bFGF (sem Cat.. PHG0024) </td><td> 10 mcg / mL </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 mL </td></tr></tbody></table> Você pode armazenar o meio KSR-FF a 2-8 ° C por até uma semana. </li><li> Pouco antes de pré-equilibrar o meio completo à temperatura e gases, adicionar assepticamente o volume necessário de 2-mercaptoetanol (55 mM de concentração de ações) para uma concentração de 0,1 mM final. Por exemplo, para preparar 100 mL da KSR-FF médio mL adicionar 182 de 55 mM 2-mercaptoetanol (1:550 diluição) Alternativamente, o 2-mercaptoetanol podem ser adicionadas ao meio 1X preenchido e armazenado a 2-8 ° C para até uma semana. </li></ol> Adaptação iPSCs a KSR-FF Médio <ol><li> Antes de começar, pré-equilibrar os seus pratos Geltrex revestidas até a temperatura ambiente no bairro. </li><li> Cultura da iPSCs em células alimentadoras MEF até que sejam confluentes 70-80%. Por favor, consulte o manual Fibroblasto GIBCO embrionárias de camundongos para protocolos baseados em MEF cultura. </li&gt; <li> Pré-aquecer o volume necessário de Dispase em um banho de água 37 ° C. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários. </li><li> Pré-equilibrar o volume necessário de KSR-FF em um banho de água a 37 ° C for15 min. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários. </li><li> Aspirar o meio dos pratos, cultura e adicionar uma quantidade adequada de solução Dispase. Incubar os pratos a 37 ° C por 3-5 minutos. </li><li> Aspirar a solução de cada navio Dispase cultura e lavar as células alimentador MEF suavemente com D-PBS (2 a 3 vezes). </li><li> Adicionar uma quantidade adequada de meio completo KnockOut SR a cada navio de cultura. Use um raspador de célula ou uma pipeta de 5 mL para raspar suavemente as células da superfície da embarcação cultura. Nota: veja o apêndice para protocolos alternativos para adaptação difícil de se adaptar as linhas de células iPS, </li><li> Recolher a suspensão de células de cada placa de cultura em diferentes tubos de 15 mL cônico. Lave cada navio cultura com uma quantidade adequada de meio completo KnockOut SR, e adicione a D-PBS lavar médio para o 15 mL tubos cônicos contendo a suspensão celular. Seja cauteloso para não quebrar os aglomerados de células em uma única célula </li><li> Centrifugar a 15 mL em tubos cônicos 200 xg por 5 minutos para sedimentar as iPSCs. </li><li> Aspirar o sobrenadante do pellet iPSC. Ressuspender o sedimento em uma quantidade adequada de KSR-FF médio de acordo com a taxa de divisão (Tabela 1). Não quebre os aglomerados de células para um tamanho menor, porque os aglomerados mais pequenos não dão bem para a superfície. Nota: Recomenda-se uma taxa de divisão de 1:2 para os primeiros três passagens após o iPSCs foram várias passagens diretamente do Meio de Cultura iPSC MEF para KSR-FF médio. Normalmente, a razão de separação 01:03 - 01:05 é apropriado, mas passaging em 01:02 garante a maior densidade de células necessárias ao adaptar em uma cultura de alimentação livre. </li><li> Antes de chapeamento do iPSCs em pratos Geltrex revestido, aspirar solução Geltrex residual do prato pré-revestidos, e lentamente adicionar uma quantidade adequada de suspensão de células de cada placa de cultura. Nota: não lavar os pratos antes de chapeamento. </li><li> Mover a placa de cultura e para trás e para os lados várias vezes para dispersar as células em toda a superfície do prato. Delicadamente, coloque o prato de cultura em uma incubadora de 37 ° C com uma atmosfera húmida de 4 a 6% CO 2 no ar. Substituir o médio gasto com KSR-FF a cada dia. </li></ol> Passaging células iPS usando KSR-FF <ol start="13"><li> Observar o iPSCs humana crescendo em completa KSR-FF sob o microscópio para confirmar que as células são 70-80% confluentes e pronto para ser repicadas. Consulte a Figura 1. Nota: Se colônias tornam-se muito denso ou muito grande, maior diferenciação ocorre. </li><li> Cortar e remover qualquer colônias diferenciada iPSC antes passaging a cultura. </li><li> Pré-aquecer o volume necessário de Dispase em um banho de água 37 ° C. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários. </li><li> Pré-equilibrar o volume necessário de KSR-FF em um banho de água a 37 ° C for15 min. Consulte a Tabela 1 abaixo para obter detalhes sobre os volumes necessários. </li><li> Aspirar o meio de gastos do navio cultura usando uma pipeta, e lavar as células duas vezes com D-PBS. </li><li> Delicadamente adicionar pré-aquecido Dispase solução para o navio de cultura (por exemplo, 1 mL de solução Dispase por 60 mm placa de cultura). Redemoinho do navio cultura para revestir a superfície da célula inteira. </li><li> Incubar a embarcação cultura a 37 ° C por 3 minutos. </li><li> Remover o navio da incubadora, aspire a solução Dispase e lavar cuidadosamente as células com D-PBS. </li><li> Raspe as células da superfície da placa de cultura com uma espátula de células, e transferência das células para um tubo de centrifugação estéril 15ml. </li><li> Lavar o prato de cultura duas vezes com KSR-FF, gentilmente &quot;pulverização off&quot; as células que não tenham destacado. Piscina do enxágüe meio com as células no tubo de 15mL. </li><li> Centrifugar o tubo a 200 xg por 5 minutos em temperatura ambiente para agregar as células. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e descartá-lo. </li><li> Agite suavemente o tubo para expulsar totalmente o pellet celular a partir do fundo do tubo. </li><li> Delicadamente ressuspender as células pré-equilibradas KSR-FF com uma pipeta de 5mL sorológicos. Não triturar. Nota: é fundamental na etapa delicadamente ressuspender as células sem usar a força para evitar danos. </li><li> Transferência das células para um novo prato de 60 mm Geltrex revestido na razão de separação desejada e mova a placa de cultura e para trás e para os lados várias vezes para dispersar as células em sua superfície. </li><li> Coloque o prato de cultura em uma incubadora de 37 ° C com uma atmosfera húmida de4 a 6% CO 2 no ar. </li><li> No dia seguinte, colocar suavemente o médio gasto com KSR-FF para remover restos celulares. Substituir o médio passou todos os dias depois. Observe as células iPS diárias e passagem-los conforme necessário (aproximadamente a cada 4-5 dias). Passaging é recomendada quando as células atingem confluência de 70-80%. Para criopreservação de células iPS e descongelamento, consulte nosso protocolo intitulado &quot;criopreservação e recuperação das células humanas iPS usando Completa KnockOut Feeder livre de substituição de soro Medium&quot;. </li></ol> Resultados esperados <img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A imagem abaixo mostra contraste de fase iPSCs cultivadas em pratos Geltrex revestido cultura usando completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum médio. O iPSCs apresentam morfologia semelhante ao hESCs, caracterizado por núcleos grandes e citoplasma escasso. (40x) <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Dish 35 milímetros </td><td> Dish 60 milímetros </td><td> Dish 100 milímetros </td></tr><tr valign="top"><td> Completa KnockOut SR médio </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr><tr valign="top"><td> Geltrex Solution </td><td> 1 mL </td><td> 1,5 mL </td><td> 4-5 mL </td></tr><tr valign="top"><td> Dispase </td><td> 0,5 mL </td><td> 1 mL </td><td> ML 3-4 </td></tr><tr valign="top"><td> D-PBS para lavagem </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Volumes recomendado <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">Por favor, clique aqui para ver o apêndice</a> .

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li><li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li><li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons.">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li><li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li></ol>

Os autores deste artigo são empregados por Life Technologies, que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Knockout DMEM/F12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. 12660-012</td>
<td>Note: see appendix for the use of alternative DMEM products</td>
</tr>
<tr>
<td>GlutaMAX-I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. No. 35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KnockOut SR, Cat. no. 10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FGF-basic, human recombinant protein, 10 &mu;g</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>bFGF, Cat. no. PHG0024</td>
<td>Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.</td>
</tr>
<tr>
<td>2-Mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. 21985-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dispase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. 17105-041</td>
<td>Note: see appendix for alternative passaging methods.</td>
</tr>
<tr>
<td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. A10480-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cat. no. 14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Tissue Culture Hood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator set at 37&deg;C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette-Aid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water Bath set at 37&deg;C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60mm Tissue Culture treated dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

feeder-free adaptation, culture and passaging of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium

A descoberta em 2006 que fibroblastos humanos e mouse poderia ser reprogramado para gerar células iPS 1-3 com qualidades muito semelhantes às células-tronco embrionárias criou uma valiosa fonte de novas células pluripotentes para descoberta de medicamentos, terapia celular, e pesquisa básica. Media GIBCO e reagentes têm estado na vanguarda da pesquisa com células-tronco pluripotentes por anos. Knockout DMEM suplementado com Knockout Serum substituição é a mídia de sua escolha para o crescimento de células-tronco embrionárias e, agora, de cultura de células iPS 3-9. Este padrão ouro sistema de mídia agora pode ser usado para alimentação livre de cultura com a adição de Knockout SR Cocktail Fator de Crescimento. ES humana e métodos tradicionais de cultura de células iPS requerem o uso de mouse ou camadas de alimentação humana de fibroblastos, ou alimentador condicionado médio. Estes métodos cultura são de trabalho intensivo, difícil de escala e é difícil manter quadris células indiferenciadas, devido às condições indefinido. Invitrogen desenvolveu Knockout SR Cocktail Fator de Crescimento para permitir que você facilmente a transição do seu celular para culturas quadris alimentador livre, mantendo o uso do SR Knockout.

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Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

O protocolo a seguir fornece instruções para a adaptação humana tronco pluripotentes induzidas (iPS) células para alimentação livre de cultura usando completa KnockOut Feeder livre de substituição de soro médio (KSR-FF). Uma vez adaptado, instruções para a manutenção contínua também são fornecidos.

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