Name: in vivo imaging of intact drosophila larvae at sub-cellular resolution
Uploaded: 2010-09-10T17:00:00
Duration: 17 min 51 s
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我们感谢安德烈亚斯Schönle，马克斯 - 普兰克学会国立精神卫生研究所，生物物理化学，德国和大卫J.桑德斯卓姆，美国马里兰州贝塞斯达，国家卫生研究院提供技术咨询。我们感谢弗兰克Kötting，欧洲神经科学研究所，哥廷根构造成像室和麻醉设备。由老年痴呆症Forschung主动TMRYZ赠款支持这项工作是由细胞和分子神经科学，蒂宾根大学的研究生院的奖学金，奖学金由中国国家留学基金管理委员会，SBH的支持。

一）大会的成像室<ol><li>选择的选择阶段的幼虫（如早期的第三龄幼虫离开约24小时的观测时间间隔在25 °，直到徘徊阶段彗星）。 </li><li>幼虫用清水冲洗干净的培养基中，民建联干。 </li><li>大衣中心室底部的元素，该地区面临的幼虫，用的卤烃油的薄膜。 </li><li>忍受的腹侧方在会议厅内的显微镜物镜面临的幼虫（使神经肌肉接头（NMJ）26日和27日进行成像）（图1 AE）。 </li><li>广场上一层油的塑料垫片，电网朝上（图1）通风槽。请确认在这一步：间隔的高度大约有一半的幼虫直径，缝隙宽度应幼虫直径的两倍左右。 </li><li>放置在显微镜的成像室</li></ol>二）幼虫麻醉<ol start="7"><li>用适当的麻醉设备/蒸发器，连接香港总商会的两个进气口。 请验证的前端： 有效地氟醚在房间内的空气浓度不应超过安全法规规定的！只有一个很小的地氟醚的总量是需要麻醉的幼虫。地氟醚1（V / V）15％的应用程序已被证明是一个很好的出发点，确定要在实验中使用的理想浓度。出于安全原因，我们建议，蒸发器，不应该包含更多地氟醚，比需要2-4小时 ，在体内成像。 </li><li>浸入一杯水室出口管的另一端，然后打开阀门控制流室约五秒钟的麻醉。 请确认在这一步： 气泡在水中升天？如果没有商会是漏水。 </li><li>关闭阀门，约三秒钟。 </li><li>在显微镜的监视残余幼虫运​​动。检查的心跳和肌肉的运动。如果有必要打开和关闭阀门，在步骤8和9所述，直到完成幼虫麻醉，然后关闭所有阀门，并开始成像。 请确认在这一步： 剩余的肌肉运动或心跳表明幼虫是不正确麻醉的。完整的麻醉是至关重要的高分辨率图像。幼虫一般应不长于15-20分钟，麻醉在一个给定的的时间。 </li></ol>三）成像<ol start="11"><li>确定正确的地位和形象的利益格局（图2-4）。 </li></ol>四）从麻醉恢复<ol start="12"><li>成像完成后，让空气进入墓室。 请确认在这一步： 检查发送的卤素灯幼虫的心跳和肌肉收缩。当肌肉开始收缩，它是安全的删除从成像室的幼虫。 </li><li>从麻醉设备分离室，从显微镜中取出。仔细拆解的商会，并放置在泥飞栽培介质的幼虫。 </li><li>存放在适当的温度在孵化器的菜。 </li></ol>五）时间序列<ol start="15"><li>重复步骤2-14，直到已获得足够的时间点。 替代协议： 如果30分钟的时间间隔内超过一次成像幼虫，它可能是实际离开它，直到下一次麻醉时间点在成像室。重复步骤7-14，直到已获得足够的时间点。 请确认在这一步： 幼虫不保存时间超过两小时的影像室，也不是它是麻醉时间长于15-20分钟。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig1.jpg" alt="图1" /> 图1成像室大会 。 （a）将上一层油的幼虫和塑料垫片。 （b）将垫片上一个22 × 22毫米盖玻片和插入室有机玻璃导环，未来（三）修复的金属环的幼虫位置，和（D）关闭室。 （e）现在是随时可以安装在显微镜室。 <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig2.jpg" alt="图2" /> 图2在果蝇幼虫体壁肌肉 。肌肉和NMJs一个CD8 + GFP - SH表达融合蛋白8的可视化。作为观察对焦时成幼虫通过角质层腹侧的肌肉显示。在最浅肌层，27，（AC）显示，在（吉隆坡）最内部的肌肉，第6和7，显示的。比例尺：100微米，片之间的ΔZ是2微米。 <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig3.jpg" alt="图3" /> 图3在果蝇幼虫体壁肌肉的身份。表明身份，是A3，段L3 果蝇幼虫的肌肉。肌肉和NMJs一个CD8 + GFP - SH表达融合蛋白8的可视化。作为观察对焦时通过角质层腹侧到幼虫的肌肉显示。最浅肌层，27岁，在AC显示，在吉隆坡的最内部的肌肉，6日和7所示。比例尺：100微米，ΔZ之间切片是2微米。 <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig4.jpg" alt="图4" /> 图4 果蝇幼虫神经肌肉接头的身份。 （AD）NMJs的一个DGluRIIA MRFP融合蛋白 1表达的可视化。 NMJs是作为观察重点是通过角质层腹侧成幼虫。在（AB），最肤浅的NMJ，27岁，是所示，在CD最内部的NMJs，6日和7所示。比例尺：100微米，ΔZ之间切片为5μm。 （E）和（F）的肤浅的（E）和更大的内部（F）的NMJs的身份，以供参考。

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最初，该方法的开发研究谷氨酸对果蝇幼虫的体壁肌肉的突触。 果蝇神经肌肉接头（NMJ）的特点是一个定型的肌肉和神经细胞的细胞质架构，因而非常适合在体内成像。然而，描述的麻醉协议是不仅限于成像NMJ果蝇幼虫的透明度，有利于适应所描述的协议的研究器官发育，细胞迁移，细胞内的亚细胞的轴突货物和重组运输。

试剂： <ul><li>地氟醚（Suprane，巴克斯特，Unterschleißheim，德国） </li><li>卤烃油（如Voltalef H10S油/法国阿托菲纳，皮托，） </li><li>飞培养基</li></ul>设备： <ul><li>倒共聚焦显微镜</li><li>双目显微镜（如STEMI 2000年，卡尔蔡司耶拿，德国） </li><li>小画笔，用来排序苍蝇</li><li>孵化器</li><li>定制成像室（对于机械制图见参考文献3） </li><li>汽化器/麻醉设备（细节见参考文献3） </li></ul>

in vivo imaging of intact drosophila larvae at sub-cellular resolution

在光学成像，基因编码的荧光基团和遗传工具最近已经启用了改进，使所需的转基因动物线的建立有效的生物过程的研究，并在生活中甚至在某些情况下的行为，有机体。在这个协议中，我们将描述如何麻醉完整的果蝇幼虫，使用挥发性麻醉剂氟烷，跟随在亚细胞决议1-3突触人口的发展和可塑性。虽然其他有用的方法来麻醉果蝇幼虫以前曾描述4,5,6,7,8，本文介绍的协议表明由于以下组合键功能显着改善：（1）麻醉的程度非常高，甚至在被逮捕的心脏跳动允许横向分辨率可达150纳米1，（2）&gt; 90％，每麻醉周期的成活率高，允许在一个小时内的五年多时间点的记录天2（ 3）高灵敏度，使我们在2个实例研究的动态表达的蛋白质在生理水平。在细节上，我们能够以可视化的突触后的谷氨酸受体亚基GluR - IIA表示，通过在稳定的转基因株系的内源性启动子1和外显子陷阱行FasII - GFP 1。 （4）与其他方法相比4,7幼虫可成像不仅活着，而且还完整无缺（即非解剖）观察到发生在若干天1。影随行的细节功能的各个部分在体内成像室2,3，幼虫，麻醉过程，如何重新确定在幼虫的具体岗位和幼虫安全拆除的正确安装，从成像会议厅。

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In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

本协议描述了一种可靠的方法，麻醉和完整的成像<em&gt;果蝇</em&gt;幼虫。我们利用挥发性麻醉药氟烷允许重复成像，在亚细胞的分辨率和结构的重新鉴定几天<sup&gt; 1</sup&gt;。

在完整的果蝇幼虫体内的亚细胞分辨率成像

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

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科研

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