Name: in vivo imaging of intact drosophila larvae at sub-cellular resolution
Uploaded: 2010-09-10T17:00:00
Duration: 17 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution at JoVE.com

Мы благодарим Андреаса Schönle, Макса-Планка-Института биофизической химии, Германии и Дэвид Дж. Сандстром, Национальный институт психического здоровья, Национального Института Здоровья, Bethesda, штат Мэриленд, США за технической консультацией. Мы благодарим Фрэнка Kötting, Европейский Институт неврологии, Геттинген для построения изображения камеры и обезболивания устройства. Эта работа была поддержана грантами от болезни Альцгеймера Forschung инициативы по TMRYZ была поддержана общение Китай совета по стипендиям, SBH на общение Высшая школа для клеточной и молекулярной неврологии, Университет Тюбингена.

) Ассамблея изображения камеры <ol><li> Выберите личинки выбрали этапе (например, ранний 3-го возраста личинки оставляя интервале наблюдения около 24 часов при 25 ° С до блуждающих этап). </li><li> Промыть водой личинки, чтобы очистить его от питательной среды и промокните насухо. </li><li> Пальто центре нижней элемент камеры, регион к лицу личинки, с тонкой пленкой галоидоуглеводородов нефти. </li><li> Положите личинки с вентральной стороне, обращенной объектива микроскопа в камере (позволяет нервно-мышечном соединении (NMJ) 26 и 27 для включения в образ) (рис. 1 АЕ). </li><li> Место пластиковую прокладку на масляный слой, с воздуха слоты сетке лицом вверх (рис. 1). Пожалуйста, убедитесь в этом шаге: высота спейсера примерно половину личиночной диаметре, ширина щели должна быть примерно в два раза диаметр личинки. </li><li> Место изображения камеры на микроскоп </li></ol> Б) обезболивания личинки <ol start="7"><li> Подключите два входа в камеру с соответствующим обезболиванием устройство / испарителем. Проверьте авансовые: Эффективная концентрация десфлуран в комнате воздуха не должна превышать величину, указанную на правила техники безопасности! Лишь очень небольшая общего объема десфлуран необходимо для обезболивания личинок. Применение 15% (объем / объем) десфлуран 1 оказалась хорошей отправной точкой для определения идеальной концентрации, которые будут использоваться в эксперименте. По соображениям безопасности мы рекомендуем испаритель никогда не должны содержать больше, чем нужно десфлуран в течение 2-4 часов в визуализации естественных условиях. </li><li> Погрузите другом конце трубки прикреплен к камере выход в стакан с водой затем открыть клапаны регулирования потока анестетика в камере в течение примерно пяти секунд. Пожалуйста, проверьте на этом этапе: Есть ли пузырьки воздуха поднимаются в воде? Если нет камеры вытекающих. </li><li> Закройте клапаны в течение примерно трех секунд. </li><li> Монитор остаточного личиночной движений в микроскоп. Проверьте оба сердца и мышечных движений. При необходимости открытия и закрытия клапанов, как описано в шаге 8 и 9, пока обезболивания личинки полно, то закрыть все клапаны и начать съемки. Пожалуйста, проверьте на этом этапе: Остаточная движения мышц или сердцебиение указывает, что личинки не правильно наркозом. Полное обезболивание является жизненно важным для изображений с высоким разрешением. Личинка правило, не должен быть под наркозом в течение более 15-20 минут в данный момент времени. </li></ol> С) изображений <ol start="11"><li> Определите правильное положение и имидж структуры процентных (рис. 2-4). </li></ol> D) Восстановление после анестезии <ol start="12"><li> После завершения визуализации позволяют воздуха в камере. Пожалуйста, проверьте на этом этапе: Проверьте биение сердца и мышечных сокращений личинки в проходящем свете галогенных. Как мышцы начинают договаривающиеся это безопасно для удаления личинок из камеры изображений. </li><li> Отсоедините камеру от обезболивания устройство и удалить его из микроскопа. Разберите камеру тщательно и месте личинки в пюре среду культивирования летать. </li><li> Магазин блюдо в инкубаторе при соответствующей температуре. </li></ol> Е) Временные ряды <ol start="15"><li> Повторите шаги 2-14 до достаточного моменты времени были получены. Альтернативный протокол: Если личинка для включения в образ больше, чем один раз в течение 30-минутного интервала может быть практичным, чтобы оставить его в камере изображение до следующего момента времени обезболивания. Повторите шаги 7-14 до достаточного моменты времени были получены. Пожалуйста, проверьте на этом этапе: Личинка не иметь в камере изображения в течение более двух часов за один раз, и это не должны быть под наркозом в течение более 15-20 минут за один раз. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1 Ассамблеи изображения камеры. () Место личинки и пластиковую прокладку на масляный слой. (Б) Место 22 х 22 мм покровным стеклом на втулку и вставить кольцо оргстекло руководство в камеру, рядом (С) фиксируют положение личинки с металлическим кольцом, и (D), близкий камеры. (E) Теперь камера готова для установки на микроскоп. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2 Body-стена мышц у личинок дрозофилы. Мышцы и NMJs были визуализированы выражение CD8-GFP-Ш гибридный белок 8. Мышцы показано как это наблюдается при фокусировке на брюшной стороне через кутикулу в личинку. В (AC) самая поверхностная мышца, 27, Показано, в (KL) наиболее интерьера мышцы, 6 и 7, показано на рисунке. Шкала Бар: 100 мкм, ΔZ между слоями составляет 2 мкм. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3 Идентичность тела стене мышц у личинок дрозофилы. Личность мышцы L3 дрозофилы личинки, сегмент A3, это показано на рисунке. Мышцы и NMJs были визуализированы выражение CD8-GFP-Ш гибридный белок 8. Мышцы отображаются как это наблюдается при фокусировке на брюшной стороне через кутикулу в личинок. В переменного тока самое поверхностное мышц, 27, показано, в КЛ самых внутренних мышц, 6 и 7, показано на рисунке. Шкала бар: 100 мкм, ΔZ между слоями составляет 2 мкм. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig4.jpg" alt="Рисунок 4" /> Рисунок 4 Идентичность нервно-мышечных соединениях личинки дрозофилы. (AD) NMJs были визуализированы выражение DGluRIIA-mRFP гибридный белок 1. NMJs показаны как это наблюдается при фокусировке на брюшной стороне через кутикулу в личинку. В (АВ) самый поверхностный NMJ, 27, Показано, в CD наиболее интерьера NMJs, 6 и 7, показано на рисунке. Шкала бар: 100 мкм, ΔZ между слоями составляет 5 мкм. (Е) и (F) идентичность поверхностных (E) и более интерьера (F) NMJs дается для справки.

<ol>
	<li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+dynamics+organizing+synapse+formation+in+vivo.">Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo.</a> Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).</li><li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]. , (1988).</li><li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses.">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li><li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+of+mitochondria.">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).</li><li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila.">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Drosophila+larva+by+multiphoton+autofluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy.</a> Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).</li><li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &. a. m. p. ;. a. m. p., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Представленный метод был первоначально разработан для изучения глутаматергической синапсы на стенки тела мышцы личинок дрозофилы. Дрозофилы нервно-мышечном соединении (NMJ) характеризуется стереотипными цито-архитектура мышц и нейронов и, таким образом, идеально подходит для обработки изображений естественных условиях. Тем не менее, описанные обезболивания протокол не ограничивается изображениями NMJ; прозрачность личинок дрозофилы облегчает адаптацию описанного протокола с целью изучения развития органов, миграция клеток, перевозки грузов и аксонального субклеточном реорганизации внутри клеток.

Реагенты: <ul><li> Десфлуран (Suprane, Бакстер, Unterschleißheim, Германия) </li><li> Хладон масла (например, Voltalef H10S масло / Atofina, Puteaux, Франция) </li><li> Fly культуральной среде </li></ul> Оборудование: <ul><li> Перевернутый конфокальной микроскопии </li><li> Бинокулярный микроскоп (например Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Германия) </li><li> Малые кисти, как использовать для сортировки мух </li><li> Инкубатор </li><li> Пользовательские построен изображения камеры (для механических чертежей см. 3.) </li><li> Испаритель / обезболивания устройство (подробнее см. 3.) </li></ul>

in vivo imaging of intact drosophila larvae at sub-cellular resolution

Последние достижения в оптических изображений, генетически закодированы флуорофоров и генетических инструментов, позволяющих эффективное создание желаемых трансгенных линий животных позволили биологических процессов, которые будут изучены в контексте жизни, а в некоторых случаях даже себя, организм. В этом протоколе мы опишем, как обезболить нетронутыми личинки дрозофилы с использованием летучих анестетиков десфлуран, следить за развитием и пластичность синаптических населения на субклеточном разрешение 1-3. Хотя другие полезные методы, чтобы обезболить личинки дрозофилы были ранее описаны 4,5,6,7,8, протокол, представленные здесь, демонстрирует значительное улучшение за счет следующих комбинированных ключевые особенности: (1) очень высокая степень обезболивания, и даже сердце билось арестован позволяет пространственным разрешением до 150 нм, 1, (2) высокая выживаемость&gt; 90% в обезболивания цикла, что позволяет запись более пяти временных точках в течение периода от нескольких часов до нескольких дней и 2 ( 3) высокая чувствительность позволяет нам в 2 случаях для изучения динамики белков, высказанные на физиологическом уровне. В деталях, мы смогли визуализировать постсинаптических субъединицы рецептора глутамата GluR-IIA выражается через эндогенные промоутер 1 в стабильной трансгенных линий и линии экзона ловушку FasII-GFP 1. (4) В отличие от других методов 4,7 личинки могут быть отображены не только жив, но и без изменений (т.е. не расчлененный), что позволяет наблюдения происходят в течение нескольких дней 1. Сопровождающих детали видео функции отдельных частей в естественных изображений камера 2,3, правильной установке личинки, обезболивания процедуры, как заново определить конкретные должности в личинки и безопасного удаления личинок из изображений камеры.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution at JoVE.com

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Этот протокол описывает надежный метод обезболивания и обработки изображений интактных<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Личинок. Мы использовали летучих анестетиков десфлуран для обеспечения повторяющихся изображений на субклеточном разрешение и повторной идентификации структур на срок до нескольких дней<sup&gt; 1</sup&gt;.

В естественных изображений интактного личинки дрозофилы на субклеточном Резолюцию

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Высокое разрешение Измерение Запах-Driven Поведение в личинки дрозофилы

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Маркировка ЭСК и hMSCs с Оксид железа наночастиц для неинвазивного в естественных условиях слежения с МРТ

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Видео высокого разрешения отслеживания передвижения у взрослых дрозофилы

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Мезоскопические флуоресцентная томография для В естественных условиях Изображений развивающихся Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

В естественных условиях центрифугирования эмбрионов дрозофилы

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

Microgavage из личинки данио рерио

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриогенеза

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Ex Метод естественных условиях для высокого разрешения подвижность ресничек у грызунов эпителия дыхательных путей

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Конфокальной микроскопии одиноких митохондриальных супероксид вспышек в интактных Сердце или<em&gt; В Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...