Name: in vivo imaging of intact drosophila larvae at sub-cellular resolution
Uploaded: 2010-09-10T17:00:00
Duration: 17 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution at JoVE.com

Vi tackar Andreas Schönle, Max-Plank-institutet för biofysikalisk kemi, Tyskland och David J. Sandström, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA för teknisk rådgivning. Vi tackar Frank Kötting, European Neuroscience Institute, Göttingen för att konstruera avbildning kammaren och anesthetization enhet. Detta arbete har finansierats med bidrag från Alzheimers Forschung initiativet till TMRYZ stöddes av en gemenskap av Kina stipendium rådet, SBH av en gemenskap av forskarskolan Cellulär och molekylär neurovetenskap, universitetet i Tübingen.

A) Montering av imaging kammaren <ol><li> Välj en larv utvalda skede (t ex tidig 3: e INSTAR larver lämnar en observation intervall på cirka 24 timmar vid 25 ° C tills vandrande scenen). </li><li> Skölj larven med vatten för att rengöra den i odlingsmedium och sandskädda den torr. </li><li> Täck mitten på nedre delen av kammaren, regionen att möta larven, med en tunn film av Halocarbon olja. </li><li> Sätt larven med den ventrala sidan mot mikroskopet mål i kammaren (låter neuromuskulära förbindelsen (NMJ) 26 och 27 som ska avbildas) (Figur 1 AE). </li><li> Placera plastmellanlägget på oljan lager med luft spår av uppåt nätet ansiktet (Figur 1 A). Bekräfta i detta steg: Höjden på spacer är ungefär hälften av larver diameter, bör bredden på slitsen vara ungefär dubbelt så stor diameter larven. </li><li> Placera avbildning kammare på mikroskopet </li></ol> B) Anesthetization av larven <ol start="7"><li> Anslut de två vikar av kammaren med en lämplig anesthetization enhet / förångaren. Bekräfta up-front: Den effektiva koncentrationen av desfluran i rummet luften ska aldrig överstiga den som anges av säkerhetsföreskrifter! Endast en mycket liten total volym på desfluran behövs för att söva larver. Tillämpningen av 15% (v / v) desfluran 1 har visat sig vara en bra utgångspunkt för att bestämma den idealiska koncentration som används i ett experiment. Av säkerhetsskäl föreslår vi att förångaren bör aldrig innehålla mer desfluran än vad som behövs i 2-4 timmar in vivo imaging. </li><li> Sänk den andra änden av röret bifogas kammaren utlopp i ett glas vatten sedan öppna ventiler som styr flödet av bedövningsmedel in i kammaren i ungefär fem sekunder. Bekräfta i detta steg: Har luftbubblor stiga upp i vattnet? Om inte kammaren läckande. </li><li> Stäng ventilerna i ungefär tre sekunder. </li><li> Övervaka kvarvarande larver rörelser i mikroskop. Kontrollera både hjärtslag och rörelser muskler. Om det behövs öppna och stänga ventiler som beskrivs i steg 8 och 9 tills anesthetization av larven är färdig, stäng alla ventiler och börja avbildning. Bekräfta i detta steg: Kvarvarande muskelrörelser eller hjärtslag indikerar att larven inte är ordentligt sövd. Komplett anesthetization är avgörande för högupplösta bilder. Larven ska normalt inte bedövas under längre tid än 15-20 minuter vid en viss tidpunkt. </li></ol> C) Imaging <ol start="11"><li> Identifiera rätt läge och bild strukturen av intresse (Figur 2-4). </li></ol> D) Återhämtning från anesthetization <ol start="12"><li> Efter bildbehandling är klar släppa in luft i kammaren. Bekräfta i detta steg: Kolla hjärtslag och muskelsammandragningar av larven som överförs halogenlampa. Eftersom musklerna börjar upphandlande det är säkert att ta bort larven från avbildning kammaren. </li><li> Lossa kammaren från anesthetization enheten och ta bort den från mikroskopet. Demontera kammaren försiktigt och placera larven i mosade flyga odling medium. </li><li> Förvara skålen i en inkubator vid lämplig temperatur. </li></ol> E) Tidsserie <ol start="15"><li> Upprepa steg 2-14 tills tillräcklig tid poäng har erhållits. Alternativa protokoll: Om larven ska avbildas mer än en gång inom en 30 minuters intervall kan det vara praktiskt att lämna den i bildbehandling kammaren tills nästa anesthetization tidpunkt. Upprepa steg 7-14 tills tillräcklig tid poäng har erhållits. Bekräfta i detta steg: Larven är inte förvaras i bildbehandling kammare för mer än två timmar åt gången, inte heller är det att vara sövd under längre tid än 15-20 minuter åt gången. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1 Montering av avbildning kammaren. (A) Placera larv och plastmellanlägget på oljan lagret. (B) Placera ett 22 x 22 halka mm locket på spacer och sätt i plexiglas styrring in i kammaren, nästa (C) fastställa positionen för larven med metallring och (D) Stäng kammaren. (E) Nu kammaren är redo att monteras på mikroskopet. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2 Body-vägg muskler i Drosophila larver. Muskler och NMJs var visualiseras genom uttryck för en CD8-GFP-SH fusionsprotein 8. Musklerna visas som observerats när fokusera på ventrala sidan genom nagelbanden i larven. I (AC) den mest ytliga muskel, 27, visas i (KL) den mest inredning musklerna, 6 och 7, visas. Skala Bar: 100 ìm är ΔZ mellan skivor 2 ìm. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3 identitet kroppen vägg muskler i Drosophila larver. Identiteten för musklerna i L3 Drosophila larver, segment A3, visas. Muskler och NMJs var visualiseras genom uttryck för en CD8-GFP-SH fusionsprotein 8. Musklerna visas som observerats när fokusera på ventrala sidan genom nagelbanden i larverna. I AC mest ytliga muskel, 27, visas i KL de mest inredning musklerna, 6 och 7, visas. Skala Bar: 100 ìm, ΔZ mellan skivor är 2 ìm. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4 Identifiering av neuromuskulära korsningar av Drosophila larver. (AD) NMJs var visualiseras genom uttryck för en DGluRIIA-mRFP fusionsprotein 1. Den NMJs visas som observerats när fokusera på ventrala sidan genom nagelbanden i larven. I (AB) den mest ytliga NMJ, 27, visas i CD mest inredning NMJs, 6 och 7, visas. Skala Bar: 100 ìm, ΔZ mellan skivor är 5 ìm. (E) och (F) identitet ytliga (E) och mer interiör (F) NMJs ges som referens.

<ol>
	<li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+dynamics+organizing+synapse+formation+in+vivo.">Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo.</a> Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).</li><li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]. , (1988).</li><li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses.">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li><li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+of+mitochondria.">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).</li><li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila.">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Drosophila+larva+by+multiphoton+autofluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy.</a> Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).</li><li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &. a. m. p. ;. a. m. p., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li></ol>

Den presenterade metoden utvecklades ursprungligen för att studera glutamaterg synapser på muskler kroppen väggen i Drosophila melanogaster larver. Den Drosophila neuromuskulära förbindelsen (NMJ) kännetecknas av en stereotypisk CYTO-arkitekturen i muskler och nervceller och är därför idealisk för in vivo imaging. Dock är de beskrivna anesthetization protokollet inte begränsat till avbildning av NMJ, insyn i Drosophila larver underlättar anpassning av de beskrivna protokollet att studera utvecklingen av organ, migration av celler, transport av axonal last och sub-cellulära omorganisation i celler.

Reagens: <ul><li> Desfluran (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Tyskland) </li><li> Halocarbon olja (t.ex. Voltalef H10S olja / Atofina, Puteaux, Frankrike) </li><li> Fly odlingsmedium </li></ul> Utrustning: <ul><li> Inverterat konfokalmikroskop </li><li> Binokulärt mikroskop (t.ex. STEMI 2000, Carl Zeiss Jena, Tyskland) </li><li> Liten pensel som används för att sortera flugor </li><li> Inkubator </li><li> Custom byggt imaging kammare (För mekaniska ritningar se Ref. 3) </li><li> Vaporizer / anesthetization enhet (För detaljer, se Ref. 3) </li></ul>

in vivo imaging of intact drosophila larvae at sub-cellular resolution

De senaste förbättringarna i optisk avbildning, genetiskt kodade fluoroforer och genetiska verktyg som möjliggör effektiv etablering av önskad transgena djur linjer har gjort det möjligt biologiska processer som skall studeras i samband med en levande, och i vissa fall till och med uppför, organism. I detta protokoll kommer vi att beskriva hur man ska söva intakt Drosophila larver, med hjälp av inhalationsanestetikum desfluran, att följa utvecklingen och plasticitet av synaptiska populationer på sub-cellulära upplösning 1-3. Medan andra användbara metoder att söva Drosophila melanogaster larverna har tidigare beskrivits 4,5,6,7,8, visar protokollet som presenteras häri betydande förbättringar på grund av följande kombinerade viktiga egenskaper: (1) En mycket hög grad av anesthetization, även de hjärtslag arresteras möjliggör lateral upplösning på upp till 150 nm 1, (2) en hög överlevnad på&gt; 90% per anesthetization cykel, som tillåter inspelning av mer än fem gång-poäng under en period av timmar till dagar 2 och ( 3) en hög känslighet gör det möjligt för oss i två fall för att studera dynamiken i proteiner uttrycks vid fysiologiska nivåer. I detalj, kunde vi visualisera postsynaptiska subenheten glutamat receptorn GluR-IIA uttryck via kroppens promotor 1 i stabila transgena linjerna och exon trap line FasII-GFP 1. (4) I motsats till andra metoder 4,7 larverna kan avbildas inte bara vid liv, men också intakt (dvs icke-dissekeras) gör observationen att ske under ett antal dagar 1. Den medföljande videon detaljer funktionen hos enskilda delar av in vivo imaging kammare 2,3, korrekt montering av larver, det anesthetization förfarande, hur man åter identifiera specifika positioner inom en larv och säker borttagning av larver från den avbildning kammare.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution at JoVE.com

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Detta protokoll beskriver en tillförlitlig metod för anesthetization och avbildning av intakt<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver. Vi har utnyttjat inhalationsanestetikum desfluran för att möjliggöra upprepad bildhantering på sub-cellulära upplösning och förnyad identifiering av strukturer för upp till ett par dagar<sup&gt; 1</sup&gt;.

In vivo Imaging av intakt Drosophila Larver på sub-cellulära upplösning

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Högupplöst Mätning av Lukt-Driven Beteende i Drosophila Larver

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Märkning hESCs och hMSCs med nanopartiklar av järnoxid för icke-invasiv in vivo-spårning med MR

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Högupplöst video Spårning av rörelseorgan hos vuxna Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoskopisk Fluorescens Tomografi för In-vivo Imaging för att utveckla Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In vivo Centrifugering av Drosophila embryon

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Förändring Living Drosophila Embryon

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

Microgavage av zebrafisk larver

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Ex vivo-metod för högupplöst avbildning av Cilia Motility i Rodent luftvägsepitel

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal avbildning av Single Mitochondrial Superoxid Blinkar i intakt hjärta eller<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...