Name: antigen specific in vivo killing assay using cfse labeled target cells
Uploaded: 2010-11-09T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells at JoVE.com

Je tiens à remercier Bianca Mothe, Carla Oseroff, et Marie-France DelGuercio pour me présenter à des tests immunologiques et de manipulation de la souris. Le travail dans le laboratoire de GA Splitter est financé par les NIH-RO1 subvention de 1-AI-073 558, GLRCE subvention de 1-U54-AI-057 153, et Bard US-3829-06.

1. Solliciter la cible des CTL spécifiques effectrices par la vaccination (jour 0) <ol><li> Avant de commencer, décider d&#39;un effecteur spécifique: le système cible. Dans cet exemple d&#39;un classique in vivo de CTL dosage, nous allons utiliser une vaccination peptide purifié à susciter spécifiques des cellules T CD8 +. Le même peptide sera utilisé pour les cellules cibles d&#39;impulsion syngéniques, la création d&#39;un effecteur spécifique: le système cible. Alternativement, vous pouvez ch...

<ol>
	<li>Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+epitope+escape+on+PD-1+expression+and+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+infection.">Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection.</a> J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).</li><li>Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+strength+of+T+cell+receptor+signal+controls+the+polarization+of+cytotoxic+machinery+to+the+immunological+synapse.">The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse.</a> Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).</li><li>Ingulli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+tolerance+and+immunity+in+vivo+by+CFSE-labeling+of+administered+cells.">Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells.</a> Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).</li><li>Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discordant+Brucella+melitensis+antigens+yield+cognate+CD8++T+cells+in+vivo.">Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo.</a> Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).</li><li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry.">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li><li>Weston, S. A., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+studies.+Analysis+by+flow+cytometry+and+fluorescence+microscopy.">New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy.</a> J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).</li><li>Akondy, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yellow+fever+virus+vaccine+induces+a+broad+and+polyfunctional+human+memory+CD8++T+cell+response.">The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response.</a> J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).</li><li>Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+antigen-driven+responses+by+flow+cytometry:+monitoring+proliferation+by+dye+dilution.">Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution.</a> Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).</li><li>Labadi, A., Balogh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+preferences+in+serosal+homing+and+distribution+of+peritoneal+B-cell+subsets+revealed+by+in+situ+CFSE+labeling.">Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling.</a> Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).</li><li>Suffner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+support+homeostatic+expansion+of+Foxp3++regulatory+T+cells+in+Foxp3.LuciDTR+mice.">Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice.</a> J Immunol. 184 (4), 1810-1820 .</li></ol>

Ce dosage peut être modifié pour enquêter sur la capacité proliférative des cellules, y compris l&#39;expansion clonale, parce CFSE divise de façon relativement égale parmi les descendants 10,11. Il est également possible d&#39;utiliser l&#39;étiquetage CFSE pour enquêter 6,12 migration cellulaire, mais il existe d&#39;autres cellules de traçage des méthodes qui peuvent être plus appropriés en fonction de votre hypothèse, pour les tétramères exemple et bioluminescence 13,</sup...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 mm glass beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biospec Products</td>
<td>11079110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70 &mu;m cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Costar</td>
<td>3799</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adjulite Incomplete Freund's Adjuvant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacific Immunology</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-5879</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>16000-077</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FC 500 Flow Cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kontes glass tissue grinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>885300-0015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Beadbeater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biospec Products</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>B-D</td>
<td>305175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm "M"</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
<td>PM992</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>157-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>10010-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PharmLyse lysing reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>555899</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11875-093</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>B-D</td>
<td>309602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vybrant CFSE Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
<td>V12883</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

antigen specific in vivo killing assay using cfse labeled target cells

Carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) peut être utilisé facilement et rapidement l&#39;étiquette d&#39;une population cellulaire d&#39;intérêt pour l&#39;enquête in vivo. Cet étiquetage a été classiquement utilisé pour étudier la prolifération et la migration. Dans la méthode présentée ici, nous avons raccourci les délais, après le transfert adoptif de regarder la survie et la mort de cellules CFSE épitope spécifique cible marquée 4-6. Le niveau de destruction spécifique d&#39;un clone cellulaire T CD8 + peuvent indiquer la qualité de la réponse, que leur quantité peut être trompeur. Spécifiques cellules T CD8 + peuvent devenir fonctionnellement épuisées au cours du temps avec une baisse de la production de cytokines et de tuer 7,8. En outre, certains clones CD8 + des lymphocytes T ne peut pas tuer ainsi que d&#39;autres avec différentes spécificités TCR 9. Pour immunité à médiation cellulaire efficace (CMI), les antigènes doivent être identifiés qui produisent non seulement un nombre suffisant de répondre cellules T, mais aussi fonctionnellement robustes cellules T répondant. Ici nous évaluons la destruction des cellules spécifiques de deux pour cent peptide spécifique des clones de lymphocytes T dans souris Balb / c.

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Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

De nombreuses infections provoquent une forte réponse CTL, mais parfois, la quantité de cellules répondant n&#39;est pas en corrélation au contrôle de l&#39;agent pathogène<sup&gt; 1</sup&gt;. Une mesure de la qualité de CTL est leur capacité à tuer spécifiquement<sup&gt; 2</sup&gt;. CFSE étiquetage des cellules cibles peuvent être utilisées pour enquêter sur cette qualité réponse CTL<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 3,4</sup&gt;.

Specific Antigen In Vivo</emTuer Assay> en utilisant des cellules CFSE cible marquée

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

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HLA-Ig des cellules à base Antigène artificielle Présentation d&#39;Efficient Ex vivo Extension du CTL humaines

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Recherche

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

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Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Tueur antigène artificielle cellules présentatrices (KaAPC) d&#39;utilisation efficace<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;épuisement des lymphocytes T humains spécifiques de l&#39;antigène

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

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Développement de cellules souches dérivées de cellules T régulatrices spécifiques de l&#39;antigène contre Autoimmunité

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Détection et enrichissement des rares cellules B spécifiques de l&#39;antigène pour l&#39;analyse des Phénotype et fonction

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

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In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test pour la détection de cellules T spécifiques de l’antigène fonction cytolytique en utilisant un modèle de Vaccination

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Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

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Specific Antigen In Vivo en utilisant des cellules CFSE cible marquée