Name: antigen specific in vivo killing assay using cfse labeled target cells
Uploaded: 2010-11-09T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells at JoVE.com

Vorrei ringraziare Bianca Mothe, Carla Oseroff, e Marie-France DelGuercio per avermi fatto conoscere saggi immunologici e gestione del mouse. Il lavoro nel laboratorio di GA Splitter è finanziato dal NIH concedere 1-RO1-AI-073558, GLRCE concedere 1-U54-AI-057153, e BARD USA-3829-06.

1. Suscitando CTL effettori target specifici di Immunizzazione (giorno 0) <ol><li> Prima di iniziare, decidere un effettore specifico: sistema di destinazione. In questo esempio di un classico test in vivo CTL, useremo una immunizzazione peptide purificato per suscitare specifiche cellule T CD8 +. Il peptide stesso sarà utilizzato per impulso delle cellule bersaglio singenici, creando un effettore specifico: sistema di destinazione. In alternativa, si può scegliere di utilizzare patogeno intero o proteine ?...

<ol>
	<li>Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+epitope+escape+on+PD-1+expression+and+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+infection.">Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection.</a> J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).</li><li>Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+strength+of+T+cell+receptor+signal+controls+the+polarization+of+cytotoxic+machinery+to+the+immunological+synapse.">The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse.</a> Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).</li><li>Ingulli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+tolerance+and+immunity+in+vivo+by+CFSE-labeling+of+administered+cells.">Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells.</a> Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).</li><li>Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discordant+Brucella+melitensis+antigens+yield+cognate+CD8++T+cells+in+vivo.">Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo.</a> Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).</li><li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry.">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li><li>Weston, S. A., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+studies.+Analysis+by+flow+cytometry+and+fluorescence+microscopy.">New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy.</a> J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).</li><li>Akondy, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yellow+fever+virus+vaccine+induces+a+broad+and+polyfunctional+human+memory+CD8++T+cell+response.">The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response.</a> J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).</li><li>Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+antigen-driven+responses+by+flow+cytometry:+monitoring+proliferation+by+dye+dilution.">Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution.</a> Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).</li><li>Labadi, A., Balogh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+preferences+in+serosal+homing+and+distribution+of+peritoneal+B-cell+subsets+revealed+by+in+situ+CFSE+labeling.">Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling.</a> Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).</li><li>Suffner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+support+homeostatic+expansion+of+Foxp3++regulatory+T+cells+in+Foxp3.LuciDTR+mice.">Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice.</a> J Immunol. 184 (4), 1810-1820 .</li></ol>

Questo test può essere modificato per indagare la capacità proliferativa delle cellule, tra cui l&#39;espansione clonale, perché CFSE divide equamente tra progenie relativamente 10,11. E &#39;anche possibile utilizzare l&#39;etichettatura CFSE per studiare la migrazione delle cellule 6,12, anche se ci sono altre cellule tracciamento metodi che possono essere più appropriato a seconda delle ipotesi, per esempio tetrameri e bioluminescenza 13, che può anche essere combinato con l&#39;...

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>1 mm glass beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biospec Products</td>
<td>11079110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70 &mu;m cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Costar</td>
<td>3799</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adjulite Incomplete Freund's Adjuvant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacific Immunology</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-5879</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>16000-077</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FC 500 Flow Cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kontes glass tissue grinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>885300-0015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Beadbeater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biospec Products</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>B-D</td>
<td>305175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm "M"</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
<td>PM992</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>157-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>10010-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PharmLyse lysing reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>555899</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11875-093</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>B-D</td>
<td>309602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vybrant CFSE Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
<td>V12883</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

antigen specific in vivo killing assay using cfse labeled target cells

Carboxyfluorescein diacetato succinimidile estere (CFSE) può essere utilizzato per etichettare facilmente e rapidamente una popolazione di cellule per un esame più vivo. L&#39;etichettatura è stata classicamente utilizzato per studiare la proliferazione e la migrazione. Nel metodo presentato qui, abbiamo accorciato la timeline dopo il trasferimento adottivo di guardare la sopravvivenza e l&#39;uccisione di epitopo specifiche cellule bersaglio CFSE etichettato 4-6. Il livello di uccidere specifiche di una T CD8 + clone di cellule in grado di indicare la qualità della risposta, in quanto la loro quantità può essere fuorviante. Specifiche cellule T CD8 + può diventare funzionale esaurito nel tempo con un calo della produzione di citochine e uccidendo 7,8. Inoltre, alcuni cloni di cellule CD8 + T non può uccidere così come gli altri con diverse specificità TCR 9. Efficace per l&#39;immunità cellulo-mediata (CMI), devono essere identificati antigeni che producono non solo un numero adeguato di risposta delle cellule T, ma anche funzionale, robusto cellule T risponde. Qui valutare l&#39;uccisione delle cellule specifiche per cento dei due cloni T peptide specifico delle cellule in topi BALB / c.

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Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Molte infezioni provocano una forte risposta CTL, ma a volte, la quantità di cellule rispondono non è correlata al controllo del patogeno<sup&gt; 1</sup&gt;. Una misura della qualità CTL è la loro capacità di uccidere specificamente<sup&gt; 2</sup&gt;. Etichettatura CFSE di cellule bersaglio può essere utilizzato per indagare questa qualità CTL risposta<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 3,4</sup&gt;.

Antigene specifico In Vivo Analisi Uccidere utilizzando cellule bersaglio CFSE etichetta

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

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