Name: the use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (cfse) to monitor lymphocyte proliferation
Uploaded: 2010-10-12T17:00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation at JoVE.com

Arbetet som redovisas i denna artikel stöddes av ett nationellt hälso-och medicinska forskningsrådet (NHMRC) i Australien Program Grant (CRP) och en NHMRC Project Grant (CRP och BJCQ). Även BJCQ är en NHMRC Peter Doherty forskarassistent.

1) Reagens Setup 1,1) CFSE stamlösning Den CFSE färgämne köps som carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFDA, SE) (MW 557,47 g / mol), vanligtvis i 25 mg injektionsflaskor. Lös upp 25 mg i 8,96 ml DMSO för en slutgiltig stamlösning av 5 mm (lagra 50-100 mikroliter alikvoter vid -20 ° C i flera månader). CFDA, SE kommer att reagera med vattenlösning så det är viktigt att sådan exponering undviks under lagring. 1,2) Lymfocyter Isolera lymfocyter från mjälten och eller lymfkörtlar från möss och återsuspendera i 1 ml odlingsmedium (t.ex. RPMI) med 5% värmeinaktiveras (HI) fetalt kalvserum (FCS), med en cell koncentration mellan 0,5 x 06 till 10 oktober x 10 7 / ml. 2) CFSE Labeling 2,1) rutinmetod: <ol class="lalpha"><li> Grundligt resuspendera cellerna i 1 mL av medium och lägg försiktigt i botten av en ny (icke-fuktade) 10 ml koniska rör. </li><li> Lägg röret horisontellt (med hjälp av en icke-fuktade röret förhindrar att 1 ml-cellsuspension från att flytta och för tidigt blandas med CFDA, SE-lösningar). </li><li> Tillsätt försiktigt 110 mikroliter PBS till den icke-fuktade delen av plasten på toppen av röret säkerställa att den inte får kontakt med cellen lösningen. </li><li> Resuspendera 1,1 mikroliter av 5 mM lager av CFDA, SE i 110 mikroliter PBS. </li><li> Snabbt locket på röret och vänd och skaka väl för att få snabb enhetlig blandning av lösningarna. Observera att CFSE färgen på en slutlig koncentration av 5 mikroM kan dock den optimala koncentrationen måste fastställas för varje förberedda parti, och sedan kontrolleras var 6 månader för att säkerställa att den är effektiv. </li><li> Inkubera cellerna i 5 min vid rumstemperatur. Notera att vid konvertering av CFDA, SE att CFSE (se diskussion) färgen blir fluorescerande och därmed utsatt för blekning av exponering för starkt ljus. Därför är det lämpligt att skydda röret från ljuset från denna punkt på, till exempel genom att täcka den med aluminiumfolie. </li><li> Tvätta cellerna genom att späda i 10 volymer av 20 ° C PBS innehållande 5% HI FCS, sedimenterande genom centrifugering vid 300 xgi 5 minuter vid 20 ° C och kasta supernatanten. Upprepa tvätta ytterligare två gånger. </li></ol> 2,2) Alternativ metod, som också är lämplig för högre cell nummer (10 - 30 x 10 7): <ol class="lalpha"><li> Förbered en 2 x (10 M) CFDA, SE-lösning genom att tillsätta 2 mikroliter av 5 mM lager till 1 mL PBS och snabbt lägga till denna till 1 ml grundligt återsuspenderade celler, sedan snabbt locket på röret och vänd och skaka väl för att få snabb enhetlig blandning. </li><li> Inkubera cellerna i 5 minuter i rumstemperatur och tvätta som i steg 2.1 (f) och 2,1 (g). </li></ol> 2,3) Celler kan sedan appliceras på ett protokoll av intresse för framkallande av celldelning. Märkta celler kan användas både in vitro och in vivo. 2,4) Efter fullföljande av spridningen analys, celler skördas och analyseras med flödescytometri (se nedan för representativa exempel). 3) representativa resultat För att bedöma lymfocyter spridning av CFSE utspädning, är det bra att känna till fluorescens odelade celler (dvs. maximal fluorescens) och icke-märkta celler (dvs minsta fluorescens). Därför bör din experimentell design ta dessa kontroller i beaktande. Nedan är exempel på in vitro och in vivo med hjälp av CFSE att mäta CD8 + T-celldelning med flödescytometri. 3,1) In vitro stimulering Figur 1 visar CFSE profiler CFSE-märkta äggalbumin (OVA)-specifika T cells receptor transgena CD8 + OT-I T-celler efter 3 dagar kultur med dendritiska celler pulsade med olika mängder av ägg. CD8 + T-celler renas från mjälte och lymfknutor OT-Jag möss märkt med CFSE och 1 x 10 5 celler odlade med 3,3 x 10 4 DC. DC där pulsade med OVA för 1 timme vid 37 ° C och tvättas två gånger innan kulturen. Efter 3 dagar, celler där skördas och märkt med anti-CD8-APC antikroppar och Hoechst 33.258 och därefter analyseras med flödescytometri (50.000 händelser samlas in). Live (Hoechst 33.258 -) är CD8 + celler visas. Som kontroller, CD8 + T-celler odlade ensam, visar CFSE intensiteten av icke indelas-celler, medan de icke-märkta celler visar automatiskt fluorescens av cellerna och begränsningarna av detekterbara celldelningar. Observera att 4 CFSE toppar kan ses i varje av de paneler som i detta exempel, vilket tyder på att cellerna har genomgått upp till 3 divisioner. 3,2) In vivo-stimulering Figur 2 visar CFSE profiler CFSE märkt OVA-specifika T cells receptor transgena CD8 + OT-I T-celler efter 3 dagar in vivo in närvaro av 20 mikrogram OVA. CD8 + T-celler renas från mjälte och lymfknutor CD45.1 congenic OT-Jag möss märkt med CFSE och 5 x 10 6 celler injiceras iv i laterala svansvenen av C56BL/6J (CD45.2 +) möss. Efter 2 tim möss injicerades IV med 20 mikrogram OVA. Efter tre dagar var mjälte från mössen in, görs till en enda cell fjädring, märkt med anti-B220-PerCP, anti-CD8-APC-Cy7 och anti-CD45.1-PE-Cy7 antikroppar och Hoechst 33.258 och sedan analyseras med flödescytometri (1.000.000 händelser samlas in). Live (Hoechst 33.258 -) B220-celler visas i vänstra panelen och gated CD8 + CD45.1 + celler som visas i högra panelen. Som kontroller, ostimulerade CFSE-märkt CD8 + T-celler, visar CFSE intensiteten av icke indelas-celler, medan de icke-märkta celler visar automatiskt fluorescens av cellerna och begränsningarna av detekterbara celldelningar. Observera att användningen av CD45 allotypic skillnaden är avgörande för att lösa de överförda CD8 + T celler från värd, eftersom de är en mindre delmängd av den totala CD8 + T-celler (till vänster). Observera att de flesta cellerna faller inom 7 CFSE toppar i detta exempel (högra panelen), vilket indikerar att cellerna har genomgått upp till 6 divisioner. <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Förmåga CFSE märkt äggalbumin (OVA)-specifika T cells receptor transgena CD8 + OT-I T-celler att svara in vitro till DC pulsade med olika koncentrationer av ägg, data visat att efter 3 dagar kulturen. Observera icke uppdelad population av CD8 + T celler i frånvaro av antigen (ljusgrå histogram) och auto-fluorescens av icke-märkta befolkningen (mörkgrå histogram). I Figur visar CD8 + T-celler som har delat 1-3 gånger baserat på CFSE utspädning toppar, med fler T-celler att dela på de högre antigen koncentrationer. <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Förmåga CFSE-märkta äggalbumin (OVA)-specifika T cells receptor transgena CD8 + OT-I T-celler, när adoptively över till C57BL / 6 möss att svara på OVA, data som visas 3 dagar efter adoptiv transfer Vänster panel:. CD8 +, CD45. 1 + OT-1 T-celler i mottagarens möss. Högra panelen: CFSE spridning profil. Notera icke uppdelad population av CD8 + T-celler i mottagarens möss som inte fick antigen (ljusgrå histogram) och auto-fluorescens av icke-märkta lymfocyter (mörkgrå histogram). I Figur visar CD8 + T-celler som har delat 1-6 gånger baserat på CFSE utspädning toppar. <img src="/files/ftp_upload/2259/2259fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. En representation av olika molekylära händelser som inträffar under märkning av celler med carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFDA, SE). För detaljer om processen se diskussion text. Obs: Den generiska förkortningen &quot;CFSE&quot;, inte CFDA, SE, används för att beskriva märkning reagens och märkning förfarandet i allmänhet. Siffran bygger på Parish 4.

<ol>
	<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry.">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).</li><li>Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+intracellular+fluorescent+dye+CFSE+to+monitor+lymphocyte+migration+and+proliferation.">Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation.</a> Current protocols in immunology. , (2009).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies.">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).</li></ol>

För att uppskatta hur CFSE fungerar och varför snabba enhetlig märkning krävs för dess användning i spridning analys är det bra att förstå den molekylära grunden för CFSE cell märkning. Denna kan delas in i två faser, 1) Cell inresa och 2) Protein märkning (Figur 3). 1) Cell post: Inmatning av färgen in i cellen medieras av det diacetylerade form av färg, carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFDA, SE). Den acetater gör färgen mycket membranet permeant låta dess snabba flux över plasmamembranet. Esteraser, vistas i cellen, klyva acetater från CFDA, SE och därmed ge upphov till CFSE form av färg som är mycket mindre membran permeant, med fokus på så sätt färgen i cellen. 2) Protein märkning: Medan både CFDA, SE och CFSE har amino-reaktiva succinimidyl sidokedjor är det bara CFSE fluorescerande. Den höga intracellulära koncentrationen av CFSE underlättar snabba och höga intracellulära märkning av proteiner. CFSE märkning av celler måste ske snabbt för att få ett homogent märkt population av celler, vilket är avgörande för att lösa celler som har genomgått flera divisioner som visas i representativa resultat (Figur 1 och 2).

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CFDA,SE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope Laboratories Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lymphocytes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eg mouse or human</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FCS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10-15ml conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon, Becton Dickinson</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminium foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Capral Aluminium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vortex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Industries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf (5810 R)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LSR-II (BD Biosciences)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (cfse) to monitor lymphocyte proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) är ett effektivt och populärt sätt att övervaka lymfocyter division 1-3. CFSE etiketter kovalent långlivade intracellulära molekyler med fluorescerande färg, carboxyfluorescein. Så när en CFSE-märkt cell delar sig, är dess avkomma utrustade med hälften av antalet carboxyfluorescein taggade-molekyler och därmed varje celldelning kan bedömas genom att mäta motsvarande minskning i cell fluorescens via flödescytometri. Kapaciteten i CFSE att märka lymfocytpopulationer med hög fluorescerande intensitet exceptionellt låg varians i kombination med dess låga celltoxicitet, gör den till en idealisk färgämne för att mäta celldelning. Eftersom det är en fluorescein-baserad färg det är också kompatibel med ett brett utbud av andra fluorokromer gör det som gäller för flera färger flödescytometri. Den här artikeln beskriver de förfaranden som normalt används för märkning mus lymfocyter för att övervaka upp till 8 celldelningar. Dessa är märkta celler kan användas för både in vitro och in vivo-studier.

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation at JoVE.com

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE etiketter kovalent långlivade intracellulära molekyler med fluorescerande färg, carboxyfluorescein. Som sådan, när en CFSE-märkt cell delar sig, dess avkomma har hälften av fluorescens, som därmed kan användas för att bedöma celldelning. Den här artikeln beskriver de förfaranden som normalt används för märkning mus lymfocyter med CFSE.

Användning av Carboxyfluorescein diacetat Succinimidyl Ester (CFSE) för att övervaka Lymphocyte spridning

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Finger-stick Blodprovstagning Metodik för bestämning av ansträngningsutlöst-lymfocyter Apoptos

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

En visuell analys för att övervaka T6SS-medierad bakteriell konkurrens

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Användning av<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging för att övervaka utvecklingen av experimentell Mouse Cytomegalovirusinfektion hos nyfödda

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Använda fluorescerande proteiner till Monitor Glycosome Dynamics i den afrikanska trypanosom

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescens att Övervaka Cellular Upptag av humant laktoferrin och dess associerade antiviral aktivitet mot hepatit C-virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Användning av flödescytometri att bedöma staten Chromatin i T-celler

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analys av vidhäftning under Shear stress för studier av T-lymfocyter-adhesionsmolekyl interaktioner

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

detektering av<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant ytglykoprotein Omkoppling av magnetkamera Aktivt cellsortering och flödescytometri

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Utveckling av en hepatit B-virus Reporter system för att övervaka de tidiga stadierna av replikationscykeln

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserar Lentiviral transduktion murina och mänskliga primära NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...