Name: changes in mammary gland morphology and breast cancer risk in rats
Uploaded: 2010-10-16T17:00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats at JoVE.com

NCI (U54 CA00100970), NCI (1 R03 CA150040-01), ACS (116602-PF-09-018-01-CNE)

1. Verwijdering van de buik borstklier en de opstelling van een hele berg <ol><li> Euthanaseren het dier volgens de IACUC richtlijnen. Pin het dier op zijn rug van zijn benen met naalden, of tape de benen op het oppervlak raad van bestuur, en veeg de huid nat met ethanol (EtOH). Til de huid een beetje met een pincet en met scherpe schaar een middellijn incisie in de huid te beginnen tussen de twee # 5 tepels en snijden in de richting van de nek. Maak een omgekeerde Y incisie vanaf de middenlijn richting de achterpoten. Als thoracale borstklieren zijn ook worden verzameld, maken ook een Y incisie vanaf de middellijn tussen de twee # 2 tepels naar de voorpoten. </li><li> Ontleden van de huid met een schaar open aan een kant van de omgekeerde Y-incisie aan de buik # 4 borstklier bloot te leggen; de borstklieren zijn bevestigd aan de huid. Pin van de huid met naalden op het oppervlak bord, volledig bloot te leggen van de klier. Werk de ene kant en klier in die tijd. </li><li> Ontleden de melkklier, zonder uit de huid hetzij met behulp van scherpe schaar en / of een scalpel, vanaf het proximale gebied dicht bij de tepel en werken aan het distale einde van de klier naar de rug van het dier. (Dit kan enkele minuten duren, vooral bij een oudere rat.) </li><li> Onmiddellijk spreiden van de vrijstaande klier op een juiste wijze gelabeld glaasje (gebruik een goede permanent marker pen en / of &#39;een diamant pen&#39;), en verspreid de klier goed overeenkomt met de oorspronkelijke grootte en vorm in situ. De glasplaatje moet groter zijn dan de klier. Na het verspreiden van de klier op de glijbaan, laat het op de tafel gaan zitten voor een tijdje, zodat de klier stokken op de glijbaan, maar laat het niet droog. </li><li> Zet de schuif in een pot met daarin Carnoy&#39;s fixatief (75% ijsazijn, 25% absolute ethanol = EtOH), laat het je vast bij kamertemperatuur (RT) in de zuurkast voor 2 dagen of langer. Dia&#39;s kunnen ook worden achtergelaten in de fixeermiddel voor een langere periode van tijd. </li><li> Was de dia&#39;s in 70% EtOH gedurende 1 uur bij RT. </li><li> Spoelen in gedestilleerd water gedurende 30 minuten bij RT. </li><li> Vlek in Carmine Alum vlek *) voor 2 dagen of langer (tot je ziet dat de lymfeklieren hebben bevlekt door, kijk naar de achterkant van de dia). </li><li> Wassen in toenemende reeks van EtOH, 1 uur in elke: 70% -&gt; 95% -&gt; 100%. Na de laatste wasbeurt in absolute EtOH de klieren zetten in xyleen. Laat zitten in de zuurkast in RT althans voor twee dagen. Deze laatste stap is het ruimen van de melkklier betekenis delipidation van het uiervet pad, en de latere toename van de transparantie. Hoe vetter de klier is de langere clearing tijd nodig is. </li><li> Mount with cover-slips met behulp van een montage van media zoals Permount. Nou laten we de dia&#39;s drogen (enkele dagen) alvorens op te merken onder een stereo-microscoop. * Carmine Alum Stain: Plaats een g karmijn (Sigma C1022) en 2,5 g aluminium kaliumsulfaat (Sigma A7167) in 500 ml gedestilleerd water en kook ze gedurende 20 minuten. Pas uiteindelijk volume van 500 ml met water. Filter en koelkast. Oplossing kan worden gebruikt voor enkele maanden. Gooi als kleur wordt zwak. </li></ol> 2. Analyse van de borstklier Hele Mount Morfologie Borstklier hele mounts morfologie wordt geanalyseerd op basis van de volgende eindpunten en de resultaten gecorreleerd met borstkanker risico. <ol><li> Borstklier whole-mount at PND 21 (pre-puberale leeftijd): <ul><li> Epitheliale groei: <ul><li> Afstand van de tepel tot aan het einde van de epitheliale boom (in millimeters), gemeten met behulp van een liniaal </li></ul></li><li> Potentieel voor maligne transformatie: <ul><li> Aantal TEBs (uiteinde knoppen), geteld onder een lichtmicroscoop. TEBs zijn de grootste bolvormige structuren zich pas aan het distale uiteinde van de borstklieren epitheliale boom </li></ul></li><li> Differentiatie: <ul><li> AB1 (alveolaire knop) score (0-5). Alveolaire knoppen zijn verspreid over het epitheel. </li><li> AB2 score (0-5) </li></ul></li></ul> Gehelen mounts worden gescoord onder een lichtmicroscoop. De score waarden van AB1 en AB2 worden toegevoegd voor een laatste differentiatie score. </li><li> Borstklier hele-mount verzameld op PND 50 (post-puberale leeftijd): <ul><li> Epitheliale groei: <ul><li> Afstand van de lymfeklieren aan het einde van de epitheliale boom (in millimeters), gemeten met behulp van een liniaal. </li><li> Afstand tussen het uiteinde van de epitheliale boom aan het einde van vet pad, gemeten met behulp van een liniaal. </li></ul></li><li> Potentieel voor maligne transformatie: <ul><li> Aantal TEBs, geteld onder een lichtmicroscoop </li></ul></li><li> Differentiatie: <ul><li> AB1 score (0-5) </li><li> AB2 score (0-5) </li><li> Melkklieren score (0-5) </li></ul></li></ul> Gehelen mounts worden gescoord onder een lichtmicroscoop. Differentiatie zal worden beoordeelt op twee manieren. Eerst worden de score waarden van AB1, AB2 en lobules toegevoegd voor een laatste differentiatie score. Daarnaast zal de verhouding tussen de melkklieren score en AB1 + AB2 score worden berekend. AB differentiëren naar melkklieren, en hoe hoger de verhouding tussen de melkklieren en ABS, het meer gedifferentieerde de klier is. </li></ol> 3. Palpatie en mammatumor Meting in ratten en correlatie met borstklier Morfologie <ol><li> Om te beginnen deze procedure, houdt de rat door vast te pakken het hele lichaam met de handpalm over de rug, met wijsvinger achter het hoofd en de duim en de tweede vinger onder het tegenovergestelde oksel. Draai de rat dus het ligt op zijn achterste, en palperen om eventuele borsttumoren op te sporen; voelbare tumoren moeten voelen als een &quot;klomp&quot;. </li><li> Naast gebruik van een schuifmaat om de breedte, lengte en hoogte van de tumor te meten. Bereken de tumor volume met behulp van de ellipsoïde formule, Volume = 1/6πabc, waar &#39;een&#39; = breedte &#39;b&#39; = lengte, en &#39;c&#39; = hoogte. </li><li> Handmatig registreren van de locatie en de grootte van de tumor in een notebook op een wekelijkse basis. Deze gegevens zullen worden overgedragen aan een spreadsheet later. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Zorgvuldige dissectie van het uiervet pad en de verwerking ervan tot wholemount zal beoordeling van de ontwikkeling staat van de borstklier. Wanneer elke stap goed is gedaan, de hele borstklier epitheliale boom is duidelijk zichtbaar in het vet pad, en dit maakt een eenvoudige vaststelling van het aantal TEBs en de berekening van de dichtheid van de alveolaire knoppen en melkklieren. Misstappen bij de voorbereiding van wholemounts kan niet de hele dikke pad, onvoldoende tot vaststelling, en inadequate clearing ontleden. Beoordeling van de borstklier morfologie zal informatie over het aantal structuren aanwezig zijn die aanleiding kunnen geven tot mammatumoren (TEBs), mate van differentiatie van de epitheliale structuren (alveolaire knoppen en melkklieren), en de mate van groei (ductaal verlenging). Het is belangrijk om TEBs scheiden om uiteinden, de laatste bevinden zich aan het distale uiteinde van het epitheel, vergelijkbaar met TEBs, maar ze zijn kleiner dan TEBs en geen aanleiding geven tot kwaadaardige tumoren. Uiteinden worden ook gezien in de epitheliale boom. <img src="/files/ftp_upload/2260/2260fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1:. Vertegenwoordiger resultaat van goed voorbereid borstklier hele berg Alle onderdelen van de klier goed zijn ontleed en karmijn kleuring is optimaal. <img src="/files/ftp_upload/2260/2260fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2:. Vertegenwoordiger gevolg van een slecht voorbereid borstklier ganse berg De klier goed is ontleed (het distale gedeelte van de klier ontbreekt), is niet behoorlijk uitgerekt en delipidation heeft niet volledig plaatsgevonden.

<ol>
	<li>Rasmussen, S. B., Young, L. J. T., Smith, G. H., Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+mammary+gland+whole+mounts+form+mice.">Preparing mammary gland whole mounts form mice.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , 75-85 (2000).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+statements+from+Mammary+Gland+Whole+Mount+Round+Robin+meeting.">Consensus statements from Mammary Gland Whole Mount Round Robin meeting.</a> , (2009).</li><li>Hilakivi-Clarke, L., Clarke, R., Onojafe, I., Raygada, M., Cho, E., &amp;amp, L. i. p. p. m. a. n., E, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+maternal+diet+high+in+n-6+polyunsaturated+fats+alters+mammary+gland+development,+puberty+onset,+and+breast+cancer+risk+among+female+rat+offspring.">A maternal diet high in n-6 polyunsaturated fats alters mammary gland development, puberty onset, and breast cancer risk among female rat offspring.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 9372-9377 (1997).</li><li>Russo, I. H., Russo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+neoplasia+in+long-term+rodent+studies.">Mammary gland neoplasia in long-term rodent studies.</a> Environ. Health Perspect. 104 (9), 938-967 (1996).</li><li>Hilakivi-Clarke, L., de Assis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+origins+of+breast+cancer.">Fetal origins of breast cancer.</a> TRENDS in Endocrinol and Metabol. 17 (9), 340-348 (2006).</li><li>Hilakivi-Clarke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+modulation+of+terminal+end+buds:+its+relevance+to+breast+cancer+prevention.">Nutritional modulation of terminal end buds: its relevance to breast cancer prevention.</a> Curr Cancer Drug Targets. 7 (4), 465-474 (2007).</li><li>Silva Idos, S., De Stavola, B., Mccormack, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+Group+On+Pre-Natal+Risk+Factors+And+Subsequent+Risk+Of+Breast+Cancer.+Birth+size+and+breast+cancer+risk:+re-analysis+of+individual+participant+data+from+32+studies.">Collaborative Group On Pre-Natal Risk Factors And Subsequent Risk Of Breast Cancer. Birth size and breast cancer risk: re-analysis of individual participant data from 32 studies.</a> PloS Medicine. 5, e193-e193 (2008).</li><li>Warri, A., Saarinen, N. M., Makela, S., Hilakivi-Clarke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+early+life+genistein+exposures+in+modifying+breast+cancer+risk.">The role of early life genistein exposures in modifying breast cancer risk.</a> Br J Cancer. 98, 1485-1493 (2008).</li><li>Russo, J., Hu, Y. F., Yang, X., Russo, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental,+cellular,+and+molecular+basis+of+human+breast+cancer.">Developmental, cellular, and molecular basis of human breast cancer.</a> J Natl Cancer Inst Monogr. , 17-37 (2000).</li><li>Oza, A. M., Boyd, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammographic+parenchymal+patterns:+A+marker+of+breast+cancer+risk.">Mammographic parenchymal patterns: A marker of breast cancer risk.</a> Epidemiological Reviews. 15, 196-208 (1993).</li></ol>

Beoordeling van de borstklier morfologische end-points en de groei van de epitheliale boom kan worden gebruikt om te voorspellen of jonge leven dieet manipulaties, of andere manipulaties die veranderen in de baarmoeder of prepuberale hormonale omgeving, later borstkanker het risico te wijzigen. Omdat borstkanker bij de mens is geïnitieerd in borstklieren structuren (terminal ductaal lobulaire eenheden, TDLUs), vergelijkbaar met TEBs bij ratten, kan deze techniek worden gebruikt om het potentieel van het vroege leven blootstelling aan het risico van borstkanker beïnvloeden vast te stellen. Verder, bij vrouwen een hoge mammografische densiteit verhoogt het risico op borstkanker wordt 4-6 vouwen, en de beoordeling van de groei van de mamma-epitheel boom kan worden gebruikt om de factoren die het borstweefsel en de factoren die deze dichtheid verminderen bepalen te identificeren. Voor het verkrijgen van deze informatie moet borstklier volledig worden ontleed, behoorlijk gespannen op een glasplaatje, zodat alle onderdelen kan gevisualiseerd worden onder een microscoop. Daarnaast zal een goede karmijn vlekken en delipidation in xyleen bieden heel mounts die geschikt zijn voor borstkanker risico-evaluatie.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glacial acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EM</td>
<td>AX0073-9</td>
<td>Carnoy's Fixative</td>
</tr>
<tr>
<td>Absolute ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The Waner-Graham Co.</td>
<td>64-17-5</td>
<td>Carnoy's Fixative</td>
</tr>
<tr>
<td>Carmine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C1022</td>
<td>Carmine solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum potassium sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7167</td>
<td>Carmine solution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

changes in mammary gland morphology and breast cancer risk in rats

Studies in knaagdiermodellen van borstkanker tonen aan dat blootstelling aan de voeding / hormonale factoren bij de in utero en puberteitsstadium perioden, waarin de borstklier uitgebreide modellering en re-modellering ondergaat, minder gevoelig maken voor carcinogeen-geïnduceerde borsttumoren. Soortgelijke bevindingen zijn beschreven in de mens: bijvoorbeeld, een hoog geboortegewicht verhoogt later risico op het ontwikkelen van borstkanker, en de inname van soja tijdens de kinderjaren verlaagt het risico op borstkanker. Het is gedacht dat deze pre-en postnatale dieet wijzigingen blijvende morfologische veranderingen in de uier die op hun beurt te wijzigen het risico op borstkanker op latere leeftijd induceren. Deze morfologische veranderingen die reflecteren epigenetische modificaties, zoals veranderingen in de DNA-methylatie, histonen en miRNA expressie die vervolgens van invloed zijn gentranscriptie. In dit artikel beschrijven we hoe veranderingen in borstklieren morfologie kan borstklier het risico op kanker te voorspellen bij ratten. Ons protocol beschrijft specifiek hoe om te ontleden en te verwijderen van de rat buik borstklier en hoe de borstklier hele mounts voor te bereiden. Het beschrijft ook hoe borstklier morfologie te analyseren op basis van drie end-points (aantal terminale einde knoppen, epitheliale rek en differentiatie) en om de gegevens te gebruiken om het risico van het ontwikkelen van borstkanker te voorspellen.

Watch this Scientific Journal Video about Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats at JoVE.com

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Ons protocol wordt beschreven hoe u de rat buik borstklier ontleden en hoe de borstklier hele mounts voor te bereiden. Het beschrijft ook hoe borstklier morfologie met behulp van drie eindpunten (aantal terminale einde knoppen, epitheliale rek en differentiatie) te analyseren en om deze resultaten te gebruiken om borstkanker het risico te voorspellen bij ratten die werden blootgesteld aan de voeding wijzigingen<em&gt; In utero</em&gt; Of tijdens de prepuberteit.

Veranderingen in de borstklier Morfologie en het risico op borstkanker bij ratten

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

Evaluatie van de ontwikkeling van de borstklier en functie in muismodellen

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Een analytisch instrument dat cellulaire morfologie Veranderingen van Drie-dimensionale Fluorescentie afbeeldingen kwantificeert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Gecombineerd Immunofluorescentie en DNA FISH op 3D-bewaarde interfase kernen aan veranderingen in 3D Nuclear Organisatie Studie

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Intraductale Injectie voor Gelokaliseerde Drug Delivery naar de muis borstklier

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirecte Immunofluorescentie op Bevroren Secties van Muis borstklier

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Vergelijking van de drie verschillende methoden voor het bepalen van de cel proliferatie in borstkanker cellijnen

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Isolatie van Intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire Matrix expressie en klier morfologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Boviene melkklier biopsie technieken

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, ...