Name: application of a nmda receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique
Uploaded: 2010-12-21T15:30:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי MH084494 (CJL), ו MH079276 ו NS060658 (CAP).

1. פורסים הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פרוסות המוח באמצעות microtome רוטט. הכנו 240 מיקרומטר פרוסות המוח התיכון אופקי isoflurane-anethetized Sprague-Dawley חולדה (Charles River Laboratories) באמצעות microtome רוטט (Microm HM 650V) בהתאם מאוניברסיטת טקסס טיפול בבעלי חיים סן אנטוניו מוסדיים ועדת שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרו את הפרוסות בתא דגירה עד שאתה מוכן להקליט. אנו משתמשים מיכל הדגירה מחומם ל 32 מעלות צלזיוס, מלאות בנוזל השדרתי מלאכותי (aCSF; מ&quot;מ): 126 NaCl, KCl 2.5, 1.25 לאא 2 PO 4, 4 MgCl 2, 2 CaCl 2, 10 דקסטרוז, 25 NaHCO 3, 1.3 חומצה אסקורבית, 2.4 pyruvate נתרן 0.05 גלוטתיון. </li></ol> 2. אלקטרו הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפרוסה לקידוח הקלטה תאיים שבו הנוזל השדרתי מלאכותי (aCSF) בשעה 35 ° C מתבצע perfused. אנו משתמשים aCSF זהה 1.2 פרט לכך 2mm MgCl 2 היה בשימוש, גלוטתיון הושמט. עבור פרוסות מוכן אופקית, אנחנו בדרך כלל לחצות את הפרוסה לאורך קו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את נוירון היעד. אנו substantia nigra דמיינו אדם נוירונים דופאמינרגיים עם מערכת לעומת שיפוע הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך אלקטרודה באמצעות אלקטרודה חולץ אלקטרוניים. אנו למשוך אלקטרודות עם התנגדות טיפ של 4-10 MΩ באמצעות micropipette P97 חולץ (החברה סאטר Instrument). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו אלקטרודה עם פתרון הפנימי הרצוי. אנו משתמשים תמיסה המכילה (מ&quot;מ): 138-K-gluconate, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0.2 EGTA, 0.0001 CaCl 2, 4 Na-ATP, 0.4 Na-GTP. הפתרון הפנימי הותאם ה-pH של 7.3 1M באמצעות KOH ו osmolarity של 270-275 mOsms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חותם gigaohm אל הנוירון הרצוי. שבר את החותם עם יניקה. זה מהווה הקלטה התא כולו. מגבר 700B Multiclamp היה בשימוש בתצורת שלנו. המגבר אמור להיות ממוקם במצב הנוכחי תפס את &#39;אני = 0 &quot;. </li></ol> 3. מוליכות Application עם הצמד הדינמי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RTXI (www.rtxi.org) הוצא להורג במחשב מהדק דינמי. המודל נכתב מותאם אישית המכיל הקולטן NMDA היה טעון לזיכרון. הנוכחי להיות מוזרק לתוך התא בזמן אמת מחושב על ידי המשוואה הבאה: אני NMDA =-g-NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3.57) * e (-V מ * 0.062))] * (V m - E-NMDA) שבו גר NMDA הוא המוליכות הרצויה (NS; כברירת מחדל, NS 0), [Mg] הוא ריכוז מגנזיום (מוגדר 1.5 מ&quot;מ בדוגמא שלנו למטה), E-NMDA הוא פוטנציאל היפוך של הקולטן NMDA (מוגדר mV 0), ו-V m הוא פוטנציאל הממברנה של התא נמדד מן המגבר (ב millivolts). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלט מהמחשב מהדק דינמי היה קשור קלט הפיקוד של המגבר דרך ממיר-to-Analog דיגיטליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגבר הושם במצב מהדק הנוכחי &quot;IC&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן המוליכות הרצויה הקולטן NMDA לתוך RTXI (למשל 40nS). אתה צריך לראות את פרץ phasic של פוטנציאל פעולה. לחלופין, מוליכות יכול להינתן RTXI באמצעות פלט אנלוגי (איור 1 א &#39;, ג&#39;(t) &quot;). גורם דרוג המתאים יש להשתמש בתוך RTXI להמיר את האות וולט כדי סימנס. </li></ol> 4. נציג תוצאות התקנה מוצלחת עבור יישום של מוליכות באמצעות מהדק דינמי מוצג באיור 1 א. באמצעות התקנה זו, עשינו הקלטה תא סומטי כל נוירון דופאמין ב nigra substantia Pars compacta. תאים דופאמינרגיים בדרך כלל אש באופן ספונטני במחירים נמוכים עם דגם דמוי קוצב לב. פרץ של פוטנציאל הפעולה יכול להיות מעוררים על ידי יישום phasic של מוליכות קולטן NMDA עם מהדק דינמי (איור 1B). <img src="/files/ftp_upload/2275/2275fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: יישום מוליכות קולטן NMDA באמצעות טכניקה מהדק דינמי. ההתקנה A. חומרה הממחישות את הקשר בין המתקן את ההקלטה תאיים והמחשב מהדק דינמי. ב &#39;פרץ של פוטנציאל פעולה הוא עורר על ידי יישום של מוליכות הקולטן NMDA 40nS בהקלטה תא שלם מתוך nigra substantia Pars compacta דופאמין נוירון.

<ol>
	<li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons.">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+clamp:+artificial+conductances+in+biological+neurons.">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clamp:+computer-generated+conductances+in+real+neurons.">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).</li><li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+clamp+comes+of+age.">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).</li><li>Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsic+neuronal+oscillator+underlies+dopaminergic+neuron+bursting.">An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting.</a> J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).</li><li>Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+role+for+GABA+receptors+on+the+firing+pattern+of+midbrain+dopaminergic+neurons.">A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הטכניקה מהדק דינמי הפגינו כאן משפר עם הטכניקה המסורתית של הזרקת זרם ישר על ידי מתן הנסיין לחקות את ההשפעות החשמלית של הפעלת הקולטן. בסרטון הזה, אנו הראו כי ניתן להוסיף את ההשפעות של הפעלת הקולטן NMDA לפעילות ספונטנית של נוירון דופאמין, כלומר פרץ של פוטנציאל הפעולה הם מעוררים. בשל הגמישות של יישום חומרה / תוכנה, מגוון רחב של הרחבות ניתן להשתמש. השלט של הזרם המוזרק ניתן להעביר משלילי לחיובי, המייצג תרחיש שבו את ההשפעות של הקולטן מופעל יוסר נוירון. נוירונים דגם, המיוצגת בדמות סדרה של משוואות דיפרנציאליות, ניתן לפתור מספרית ולאפשר הנסיין לחקור רשתות קטנות.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>K-gluconate anhydrous</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2 X 2H2O</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N&#x2019;,N&#x2019;-tetraacetic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>EGTA; Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgATP</td>
<td>Reagent</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaGTP</td>
<td>Reagent</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaH2PO4, Anhydrous</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CholCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ascorbic Acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutathione</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)</td>
<td>Microscope</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 A/D converters</td>
<td>Equipment</td>
<td>e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multiclamp 700B with CV-7B headstage</td>
<td>Equipment</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sutter Instrument Company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microfil syringe needles</td>
<td>Equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Siskiyou, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monitor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Triview</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

application of a nmda receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique

מדעני מוח ללמוד את תפקוד המוח על ידי חוקרת כיצד הנוירונים במוח מתקשרים. חוקרים רבים להסתכל על שינויים בפעילות החשמלית של אחד או יותר נוירונים בתגובה קלט בניסוי מבוקר. הפעילות החשמלית של הנוירונים יכול להיות מוקלט פרוסות המוח מבודד באמצעות מהדק טכניקות תיקון עם micropipettes זכוכית. באופן מסורתי, הנסיינים יכולים לחקות קלט עצביים בהזרקה ישירה של זרם דרך גירוי פיפטה, חשמל של תאים אחרים או קשרים axonal שנותרו פרוסה, או מניפולציה תרופתי על ידי קולטנים הממוקמים בקרום התא של הנוירונים המוקלט. הזרקה ישירה הנוכחי יש את היתרונות של העברת צורת הגל הנוכחי מראש עם דיוק גבוה הזמני באתר של ההקלטה (בדרך כלל סומה). עם זאת, זה לא משנה את ההתנגדות של הקרום עצביים כמו תעלות יונים לא נפתחים פיזית. הזרקת נוכחי בדרך כלל מעסיקה פולסים מלבני ולכן אינו מודל קינטיקה של תעלות יונים. לבסוף, הזרקת הנוכחי לא יכול לחקות את השינויים הכימיים בתא המתרחשת עם פתיחת תעלות יונים. רצפטורים יכול להיות מופעל באופן פיזי על ידי גירוי חשמלי או תרופתי. הנסיין יש דיוק טוב הזמני של הפעלת קולטן עם גירוי חשמלי של הפרוסה. הדיוק המרחבי עם זאת, אין הוא מוגבל של הפעלת קולטן ואת האופי המדויק של מה מופעל על הגירוי אינו ידוע. בעיה זו האחרונה ניתן להקל באופן חלקי על ידי סוכני תרופתי ספציפי. למרבה הצער, במהלך תקופה של הפעלת סוכנים תרופתי הוא איטי בדרך כלל ואת הדיוק המרחבי של תשומות על התא שנרשם אינו ידוע. הטכניקה מהדק דינמי מאפשר הנסיין לשנות הנוכחי עבר ישירות אל תוך התא על סמך משוב בזמן אמת של פוטנציאל הממברנה של התא (רובינסון Kawai 1993, שארפ et al, 1993a, b;. לבדיקה, לראות פרינץ et al. 2004). זה מאפשר הנסיין לחקות את השינויים החשמליים המתרחשים באתר ההקלטה בתגובה הפעלת הקולטן. בזמן אמת שינויים הנוכחית להחיל נקבעים על ידי משוואה מתמטית מיושם בחומרה. השתמשנו לאחרונה את הטכניקה מהדק דינמי לחקור את הדור של פרצי הפוטנציאלים לפעולה על ידי הפעלת phasic של קולטני NMDA בנוירונים דופאמינרגיים של nigra substantia Pars compacta (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010).. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ההליכים הדרושים כדי להחיל מוליכות הקולטן NMDA לתוך נוירון דופאמין.

Watch this Scientific Journal Video about Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique at JoVE.com

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

בסרטון זה אנו מדגימים כיצד להחיל המוליכות לתוך נוירון דופאמין רשמה בתצורת תא שלם פרוסות המוח עכברוש. טכניקה זו נקראת מהדק דינמי.

יישום של מוליכות קולטן NMDA במוח התיכון נוירונים עכברוש דופאמין באמצעות טכניקה הצמד הדינמי

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

אפנון סביבתי של מספר המוח התיכון דופמין נוירונים בעכברים בוגרים

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

זיהוי אמין של חיים דופאמין נוירונים תרבויות המוח התיכון באמצעות רצף RNA ו- TH-מונחה האמרגן ביטוי eGFP

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

הערכה סימולטנית של המודינמיקה מוחית ופיזור תכונות אור של<em&gt; In vivo</em&gt; מוח עכברוש באמצעות הדמית החזרה המפוזרת Multispectral

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...