Name: application of a nmda receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique
Uploaded: 2010-12-21T15:30:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique at JoVE.com

Эта работа была поддержана MH084494 (CJL), а MH079276 и NS060658 (CAP).

1. Подготовка фрагментов <ol><li> Вырезать мозга ломтиками использованием вибрирующей микротоме. Мы подготовили 240 мкм горизонтальных срезов мозга от ИФ-anethetized Sprague-Dawley крыс (Charles River Laboratories) использованием вибрирующей микротома (Microm HM 650V) в соответствии с Техасского университета в Сан-Антонио Институциональные уходу и использованию животных комитета. </li><li> Держите ломтики в камере инкубации пока не будете готовы к записи. Мы используем инкубационный контейнер нагревается до 32 ° C и наполнен искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF; в мм): 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 2 MgCl 2, CaCl 2, 10 декстрозы, 25 NaHCO 3, 1,3 аскорбиновой кислоты, 2,4 пируват натрия и 0,05 глутатиона. </li></ol> 2. Электрофизиологические Запись <ol><li> Передача квант внутриклеточных установки записи, в которых искусственным спинномозговой жидкости (aCSF) при 35 ° C в настоящее время перфузии. Мы используем те же aCSF как и в 1,2 исключением того, что 2 мМ MgCl 2 был использован и глутатион был опущен. Для горизонтально подготовленные ломтики, которые мы обычно делят пополам ломтик вдоль средней линии. </li><li> Визуализируйте цель нейрона. Мы визуализировать отдельные черной субстанции дофаминергических нейронов с изображениями система отличие градиент. </li><li> Вытяните электрода с помощью электронной съемник электрода. Тянем электродами с наконечником сопротивлением 4-10 МОм использованием P97 микропипетки съемник (Саттер Instrument Company). </li><li> Заполнить электрод с желаемой внутреннее решение. Мы используем раствор, содержащий (в мм): 138 К-глюконат, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0,2 EGTA, 0.0001 2 CaCl, 4 Na-АТФ, 0,4 Na-GTP. Внутренние раствора доводили до рН 7,3 использованием 1М КОН и осмолярность 270-275 mOsms. </li><li> Сделать gigaohm печать на нужный нейрон. Разрыв печать с всасывания. В этом заключается весь записи клетки. Усилитель Multiclamp 700B был использован в нашей конфигурации. Усилитель должен быть помещен в текущем режиме зажим &#39;I = 0&#39;. </li></ol> 3. Проводимость приложения с динамической Clamp <ol><li> RTXI (www.rtxi.org) был выполнен на компьютере динамическую зажимом. Пользовательских письменного модели, содержащей NMDA-рецепторов был загружен в память. Тока, вводят в клетку в реальном времени рассчитывается по следующей формуле: Я NMDA =-г NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3,57) * е (-V м * 0,062))] * (V м - E NMDA), где г NMDA является искомой проводимости (в нс; По умолчанию установлено в 0 нс), [Mg] является концентрация магния (устанавливается до 1,5 мм в нашем примере ниже), E NMDA есть потенциал реверсии для NMDA-рецепторов (установлен в 0 мВ) и V м мембранный потенциал ячейки измеряется от усилителя (в милливольтах). </li><li> Вывод динамических компьютер зажим был подключен к командной вход усилителя через аналого-цифровой преобразователь. </li><li> Усилитель был помещен в текущем режиме зажим &#39;IC&#39;. </li><li> Введите желаемый NMDA рецепторов проводимости в RTXI (например 40nS). Вы должны увидеть фазовый взрыв потенциалов действия. Кроме того, проводимость может быть предоставлена ​​RTXI через аналоговый выход (рис. 1А, &quot;г (т) &#39;). Соответствующий коэффициент масштабирования следует использовать в течение RTXI для преобразования сигнала от вольт для Siemens. </li></ol> 4. Представитель Результаты Успешной установки для применения проводимости с помощью динамического зажима показан на рисунке 1а. С помощью этой установки, мы сделали все соматической клетки записи с дофаминергических нейронов в черной субстанции Парс компактов. Дофаминергической клетки обычно спонтанно огонь по низким ценам с кардиостимулятором, как шаблон. Взрыв потенциалы действия могут быть вызваны фазовыми применения NMDA-рецепторов проводимости с динамическим зажим (рис. 1В). <img src="/files/ftp_upload/2275/2275fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1: Применение NMDA-рецепторов проводимости с помощью динамического техника зажима. А. Аппаратное обеспечение иллюстрирующие связь между внутриклеточными установки записи и динамических компьютер зажимом. Б. взрыв потенциалов действия вызывается путем применения 40nS NMDA-рецепторов проводимость в целом запись клетки от черной субстанции Парс компактов дофаминергических нейронов.

<ol>
	<li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons.">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+clamp:+artificial+conductances+in+biological+neurons.">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clamp:+computer-generated+conductances+in+real+neurons.">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).</li><li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+clamp+comes+of+age.">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).</li><li>Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsic+neuronal+oscillator+underlies+dopaminergic+neuron+bursting.">An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting.</a> J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).</li><li>Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+role+for+GABA+receptors+on+the+firing+pattern+of+midbrain+dopaminergic+neurons.">A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Динамический метод зажима продемонстрировали здесь улучшает традиционную технику постоянного тока инъекции, позволяя экспериментатором, чтобы имитировать электрических эффектов активации рецептора. В этом видео, мы показали, что можно добавить эффекты активации NMDA-рецепторов к спонтанной активности дофаминергических нейронов, то есть взрыв потенциалов действия вызываются. Благодаря гибкости аппаратной / программной реализации, различные расширения могут быть использованы. Знак вводится ток может быть включен с отрицательного на положительный, что составляет сценарий, при котором эффекты активированного рецептора удаляется из нейрона. Модель нейронов, представить в виде серии дифференциальных уравнений, также может быть решена численно и позволяет экспериментатору для исследования малых сетей.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>K-gluconate anhydrous</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2 X 2H2O</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N&#x2019;,N&#x2019;-tetraacetic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>EGTA; Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgATP</td>
<td>Reagent</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaGTP</td>
<td>Reagent</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaH2PO4, Anhydrous</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CholCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ascorbic Acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutathione</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)</td>
<td>Microscope</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 A/D converters</td>
<td>Equipment</td>
<td>e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multiclamp 700B with CV-7B headstage</td>
<td>Equipment</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sutter Instrument Company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microfil syringe needles</td>
<td>Equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Siskiyou, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monitor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Triview</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

application of a nmda receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

Watch this Scientific Journal Video about Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique at JoVE.com

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

В этом видео показано, как применять проводимости в дофаминергических нейронов, записанные в целом конфигурации клетки в срезах мозга крыс. Эта техника называется динамическим зажимом.

Применение NMDA-рецепторов в проводимости мозга крысы дофаминергических нейронов с помощью динамического Техника Clamp

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Органотипической культур Кусочек Эмбриональные Брюшной мозга: системы по изучению дофаминергической нейронов развития В пробирке</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Одоранта вызванных ответов Записано от обонятельных нейронов рецептора с помощью техники Всасывание пипеткой

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

В ово Электропорация в Chick мозга для изучения функции генов в развитии дофаминергической Нейрон

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Реализация динамического Хомут с Synaptic и искусственного проводимости в мыши ганглиозных клеток сетчатки

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Первичная культура Mouse дофаминергических нейронов

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Экологические модуляций Количество мозга допамина нейронов у взрослых мышей

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Перфорированные патч-зажим записи из мышей Обонятельные сенсорные нейроны в неповрежденном нейроэпителии: Функциональный анализ нейронов выражая идентифицированного одоранта рецептор

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Количественное нитевидных актина (F-актин) Puncta на крысиной корковых нейронов

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Надежная идентификация живых дофаминергических нейронов в мозге культур с использованием РНК-секвенирования и TH-промотор-приводом EGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Одновременная оценка церебральной гемодинамики и свойств рассеяния света<em&gt; В Vivo</em&gt; Мозга крысы с помощью мультиспектральных диффузной отражательной визуализации

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...