Name: application of a nmda receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique
Uploaded: 2010-12-21T15:30:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique at JoVE.com

Detta arbete stöddes av MH084494 (CJL) och MH079276 och NS060658 (CAP).

1. Slice Förberedelser <ol><li> Skär hjärnan skivor med hjälp av en vibrerande mikrotomen. Vi förberedde 240 ìm horisontella mitthjärnan skivor ur en isofluran-anethetized Sprague-Dawley råtta (Charles River Laboratories) med en vibrerande mikrotom (microM HM 650V) i enlighet med University of Texas i San Antonio Institutional Animal Care och användning kommittén. </li><li> Förvara skivorna i en inkubation kammare tills du är redo att spela in. Vi använder en inkubationstid behållare uppvärmd till 32 ° C och fylld med konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF, i mm): 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 2 CaCl 2, 10 dextros, 25 NaHCO 3, 1,3 askorbinsyra, 2,4 natrium pyruvat och 0,05 glutation. </li></ol> 2. Elektrofysiologiska inspelning <ol><li> Överför slice till intracellulära inspelning rigg som en konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF) vid 35 ° C är perfusion. Vi använder samma aCSF som i 1,2 förutom att 2mm MgCl 2 används för var och glutation utelämnats. För horisontellt beredd skivor, HALVERA vi vanligtvis bit längs mittlinjen. </li><li> Visualisera målet neuron. Vi visualiseras enskilda substantia nigra dopaminerga nervceller med en lutning kontrast imaging system. </li><li> Dra en elektrod med en elektronisk elektrod avdragare. Vi drar elektroder med en spets motstånd 4-10 Mohm med hjälp av en P97 Mikropipett avdragare (Sutter Instrument Company). </li><li> Fyll en elektrod med önskad intern lösning. Vi använder en lösning innehållande (i mm): 138 K-glukonat, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl 2, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP. Den interna lösningen var anpassad till ett pH på 7,3 med 1M KOH och en osmolaritet 270-275 mOsms. </li><li> Gör en gigaohm tätningen på önskat neuron. Ruptur tätningen genom avsugning. Detta utgör en hel cell inspelning. En Multiclamp 700B förstärkare användes i vår konfiguration. Förstärkaren ska sedan placeras i &quot;I = 0 &#39;strömtång läge. </li></ol> 3. Konduktans Ansökan med Dynamic Clamp <ol><li> RTXI (www.rtxi.org) utfördes på den dynamiska klämman dator. En anpassad skriftligt modell som innehåller en NMDA-receptorn laddades in i minnet. Den ström som skall injiceras in i cellen i realtid beräknas genom följande ekvation: Jag NMDA =-g NMDA * [1 / (1 ​​+ ([mg] / 3,57) * e (-V m * 0,062))] * (V m - E NMDA) där g NMDA är det önskade konduktansen (i NS; som standard inställd på 0 ns), [mg] är magnesium koncentrationen (satt till 1,5 mm i vårt exempel nedan) är E NMDA återföring potential för NMDA-receptorn (satt till 0 mV), och V M är membranpotential i cellen mätt från förstärkaren (i millivolt). </li><li> Utgången från den dynamiska klämman datorn var ansluten till Command ingången på förstärkaren via en analog-till-digital-omvandlaren. </li><li> Förstärkaren placerades i &quot;IC&quot; strömtång läge. </li><li> Ange ditt önskade NMDA-receptorn konduktansen i RTXI (t.ex. 40nS). Du bör se en phasic explosion av aktionspotentialer. Alternativt kan en konduktans ges till RTXI via en analog utgång (Figur 1A, &#39;g (t)). En lämplig skalfaktor måste användas inom RTXI för att konvertera signalen från volt till Siemens. </li></ol> 4. Representativa resultat En framgångsrik modell för tillämpning av en konduktans med det dynamiska klämman visas i Figur 1A. Med denna inställning, gjorde vi en hel cell somatiska inspelning från en dopaminerga neuron i substantia nigra pars compacta. Dopaminerga celler brand vanligtvis spontant till låga priser med en pacemaker-liknande mönster. Ett utbrott av aktionspotentialer kan framkallas genom phasic tillämpning av en NMDA-receptorn konduktans med dynamiska klämma (Figur 1B). <img src="/files/ftp_upload/2275/2275fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1: Tillämpning av en NMDA-receptorn konduktans med det dynamiska klämman tekniken. A. maskinvaruinstallation illustrerar sambanden mellan de intracellulära inspelning riggen och dynamiska klämma dator. B. En explosion av aktionspotentialer framkallas genom tillämpning av en 40nS NMDA-receptorn konduktans i en hel cell inspelning från en substantia nigra pars compacta dopaminerga neuron.

<ol>
	<li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons.">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+clamp:+artificial+conductances+in+biological+neurons.">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clamp:+computer-generated+conductances+in+real+neurons.">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).</li><li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+clamp+comes+of+age.">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).</li><li>Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsic+neuronal+oscillator+underlies+dopaminergic+neuron+bursting.">An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting.</a> J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).</li><li>Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+role+for+GABA+receptors+on+the+firing+pattern+of+midbrain+dopaminergic+neurons.">A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).</li></ol>

Den dynamiska clamp tekniken visat här förbättrar den traditionella tekniken för likström injektion genom att låta försöksledaren att härma den elektriska effekten av en aktivering av en receptor. I den här filmen har vi visat att man kan lägga till effekterna av aktivering av en NMDA-receptorn till spontan aktivitet i dopaminerga neuron, dvs en explosion av aktionspotentialer frammanade. Tack vare flexibiliteten i hårdvara / mjukvara genomförande, kan en mängd olika tillägg användas. Tecknet av den injicerade strömmen kan kopplas om från negativt till positivt, vilket motsvarar ett scenario där effekterna av aktiverade receptorn tas bort från en neuron. Modell nervceller, representerad i form en serie av differentialekvationer, kan också vara numeriskt lösa och låta försöksledaren att undersöka små nätverk.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>K-gluconate anhydrous</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2 X 2H2O</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N&#x2019;,N&#x2019;-tetraacetic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>EGTA; Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgATP</td>
<td>Reagent</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaGTP</td>
<td>Reagent</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaH2PO4, Anhydrous</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CholCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ascorbic Acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutathione</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)</td>
<td>Microscope</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 A/D converters</td>
<td>Equipment</td>
<td>e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multiclamp 700B with CV-7B headstage</td>
<td>Equipment</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sutter Instrument Company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microfil syringe needles</td>
<td>Equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Siskiyou, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monitor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Triview</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

application of a nmda receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique

Neuroforskare studera hjärnans funktion genom att undersöka hur nervceller i hjärnan kommunicerar. Många utredare titta på förändringar i den elektriska aktiviteten i en eller flera nervceller som svar på ett experimentellt kontrollerade ingång. Den elektriska aktiviteten i nervceller kan spelas in i isolerade hjärnan skivor med hjälp av tekniker patch clamp med glas mikropipetter. Traditionellt kan praktiker härma neuronala ingång genom direkt injicering av ström genom pipetten, elektrisk stimulering av de andra cellerna eller återstående axonal anslutningar i segmentet, eller farmakologisk manipulation av receptorer som finns på neuronala membran av det inspelade cellen. Likström injektionen fördelar som passerar en förutbestämd vågform med hög temporal precision på platsen för inspelningen (vanligtvis soma). Däremot ändras inte motståndet av neuronala membran som ingen jonkanaler fysiskt öppnas. Aktuell injektion använder oftast rektangulär pulser och därför inte modell kinetiken av jonkanaler. Slutligen kan nuvarande injektion inte efterlikna kemiska förändringar i cellen som sker med öppnandet av jonkanaler. Receptorer kan vara fysiskt aktiveras av elektrisk eller farmakologisk stimulering. Försöksledaren har goda tidsmässiga precision aktivering av receptorn med elektrisk stimulering av segmentet. Det finns dock begränsad rumslig precision på aktivering av receptorn och den exakta innebörden av vad som aktiveras vid stimulering är okänd. Det senare problemet kan delvis lindras genom specifika farmakologiska agenter. Tyvärr är den tid under aktivering av farmakologiska agenter vanligtvis långsam och den rumsliga precision ingångar på inspelade cellen är okänd. Den dynamiska clamp tekniken tillåter en försöksledaren att ändra den aktuella gick direkt in i cellen bygger på feedback i realtid av membranet potentialen i cellen (Robinson och Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. För granskning, se Prinz et al. 2004). Detta möjliggör en försöksledaren att efterlikna de elektriska förändringar som sker på platsen för inspelningen som svar på aktivering av en receptor. Ändringar i realtid i tillämpad aktuella styrs av en matematisk ekvation genomförs i hårdvara. Vi har nyligen använt den dynamiska klämman tekniken för att undersöka generationen av skurar av aktionspotential genom phasic aktivering av NMDA-receptorer i dopaminerga nervceller i substantia nigra pars compacta (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010.). I denna video visar vi de förfaranden som behövs för att tillämpa en NMDA-receptorn konduktans i en dopaminerga neuron.

Watch this Scientific Journal Video about Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique at JoVE.com

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

I denna video visar vi hur man tillämpar en konduktans i en dopaminerga neuron registreras i hela cellen konfiguration i skivor råtta hjärnan. Denna teknik kallas den dynamiska klämman.

Tillämpning av en NMDA-receptorn Konduktans av dopaminerg Rat mitthjärnan Nervceller med det dynamiska Clamp Teknik

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice kulturer av embryonala på magen mitthjärnan: Ett system att studera Dopaminerga nervsystemets utveckling In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Luktämne-inducerade svar in från luktreceptorceller Nervceller användning av tekniken Sug Pipettera

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

I ovo elektroporering i Chick mitthjärnan för att studera genfunktion av dopaminerg Neuron utveckling

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Implementera Dynamic Clamp med Synaptic och artificiella konduktanser i Mus Retinal ganglion celler

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primär kultur av mus dopaminerga neuroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Miljö modulation av antalet mitthjärnan dopaminneuroner i vuxna möss

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Perforerade Patch-clamp inspelning av Mouse Olfactory sensoriska neuroner i Intakt neuroepithelium: Funktionell analys av nervceller som uttrycker en identifierad luktreceptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Kvantifiering av fintrådiga aktin (F-aktin) puncta i Rat kortikala Neuroner

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Tillförlitlig identifiering av Living dopaminerga neuroner i mellanhjärnan kulturer Använda RNA sekvensering och TH-promotor-driven EGFP uttryck

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Samtidig utvärdering av cerebral Hemodynamik och ljusspridande egenskaper hos<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Brain Använda Multispektrala diffus reflektans Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...