Name: protein crystallization for x-ray crystallography
Uploaded: 2011-01-16T16:03:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Crystallization for X-ray Crystallography at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרס בורוז החוקר ברוכים הבאים י&quot;מ ועל ידי עמיתי בראון-Coxe דוקטורים מאוניברסיטת ייל MD.

חומרים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם חלבון - ליזוזים (50 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תליית 24 גם מגש ירידה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישיבה ירידה של 24 היטב מגש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microbatch התגבשות 96 מגש טוב </li><li style=";text-align:right;direc...

<ol>
	<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).</li><li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments.">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li><li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth.">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li><li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+(CSN7).">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li><li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Macromolecule+Crystallization+Database,+Version+3.0:+new+features,+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data.">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li><li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+matrix+sampling:+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins.">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li><li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li><li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+mining+crystallization+databases:+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens.">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li><li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+growth+of+proteins,+nucleic+acids,+and+viruses+in+gels.">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallization of biological macromolecules. , (1999).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li><li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics:+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome.">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li></ol>

במאמר זה אנו מתארים ולהפגין פרוטוקולים הנוכחי כללית התגבשות החלבון. מאז אותו הליך רב שלבי יש כמה שיקולים אחד צריך להיות מודע. כאשר עובדים עם כמויות קטנות מאוד (0.5-2 μL), ייבוש הירידה עקב התאדות הוא החשש העיקרי. לפיכך, מומלץ לעבוד בסביבה מבוקר היטב (עם זרימת אוויר נמוכה, ל?...

<table border="1">
		<tbody>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>L6876-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well VDX Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-142</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well Cryschem Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-158</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dow Corning Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-510</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Siliconized glass circle coverslides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-231</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>100% paraffin oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-411</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-511</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-098</td>
<td>&nbsp;</td>	</tr>	</tbody>
		</table>

protein crystallization for x-ray crystallography

באמצעות מבנה תלת ממדי של מקרומולקולות ביולוגיות להסיק כיצד הם פועלים היא אחד התחומים החשובים ביותר של הביולוגיה המודרנית. הזמינות של מבנים ברזולוציה אטומית מספק הבנה עמוקה וייחודית של תפקוד החלבון, ומסייע לפענח את אופן פעולתו של התא החי. נכון להיום, 86% חלבון נתוני הבנק (rcsb-PDB) הערכים הם מבנים macromolecular שנקבעו באמצעות קרני רנטגן קריסטלוגרפיה. כדי לקבל גבישים מתאימים ללימודי קריסטלוגרפיים, מקרומולקולה (למשל חלבון, חומצות גרעין, חלבונים מורכבים או חלבונים מורכבים חומצת גרעין) חייבים להיות מטוהרים הומוגניות, או קרוב ככל האפשר אל ההומוגניות. ההומוגניות של התכשיר הוא גורם מפתח בהשגת גבישים כי diffract ל ברזולוציה גבוהה (Bergfors, 1999; מקפרסון, 1999). התגבשות דורש להביא את מקרומולקולה כדי רוויה. המדגם ולכן צריך להיות מרוכזים כדי הריכוז הגבוהה ביותר האפשרית מבלי לגרום להצטברות משקעים או של מקרומולקולה (בדרך כלל 2-50 מ&quot;ג / מ&quot;ל). הצגת המדגם לסוכן מזרז יכול לקדם את נוקלאציה של גבישי חלבון בתמיסה, אשר עלולה לגרום תלת ממדי גבישים גדולים גדל מפתרון. ישנן שתי שיטות עיקריות להשיג גבישים: דיפוזיה אדי התגבשות אצווה. ב אדי דיפוזיה, ירידה המכיל תערובת של פתרונות נמהר וחלבון אטום בתא עם נמהר טהור. אדי מים ואז מפזרת את הירידה עד osmolarity הירידה ואת נמהר שווים (איור 1 א). התייבשות גורמת לירידה של ריכוז של חלבון איטי וגם מזרז עד שיווי המשקל מושגת, אידיאלי באזור נוקלאציה קריסטל של הדיאגרמה שלב. השיטה מסתמכת על אצווה להביא את החלבון ישירות לתוך אזור נוקלאציה על ידי ערבוב חלבון עם כמות מתאימה של נמהר (איור 1B). שיטה זו מבוצעת בדרך כלל תחת פרפין / שמן תערובת מינרלים כדי למנוע דיפוזיה של מים מתוך הירידה. להלן נדגים שני סוגים של התקנה ניסיונית דיפוזיה אדי, תלוי ירידה ושחרר ישיבה, בנוסף התגבשות אצווה תחת שמן.

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Crystallization for X-ray Crystallography at JoVE.com

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

מבנה 3-D של מולקולה מספק הבנה ייחודית של כמה פונקציות מולקולה. השיטה העיקרית לקביעת המבנה ברזולוציה כמעט אטומי הוא רנטגן קריסטלוגרפיה. כאן, אנו להדגים את השיטות הקיימות לקבלת גבישים תלת ממדי של מקרומולקולה נתון זה מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.

חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

לא פולשני-3D ויזואליזציה עם תת מיקרון החלטה שימוש Synchrotron-X-ray-טומוגרפיה

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

הערכת דו מימדי ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה קטנים ללימודי לביולוגיה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונים

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

הדפסת 3D של Preclinical רנטגן הממוחשבים טומוגרפית נתוני סטים

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

שיפור שיעור ההצלחה של התגבשות חלבון על ידי Microseed מטריקס אקראי הקרנה

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...