Name: stable isotopic profiling of intermediary metabolic flux in developing and adult stage caenorhabditis elegans
Uploaded: 2011-02-27T14:00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans at JoVE.com

この作品は、国立衛生研究所（K08 - DK073545とNICHDが支援する知的発達障害研究センター新奨励賞）、フィラデルフィア財団、およびペンシルベニア州マケイブ賞の大学（MJF）だけでなく、トリスタンの一部で賄われていたミューレン基金（MJFとMY）。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

<ol>
	<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: A practical approach. , (1999).</li><li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li><li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids.">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans.">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li><li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes.">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, 37-41 (2010).</li><li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span.">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

中間代謝物の同位体存在度を測定する質量分析法を適用すると、重要な生化学的変化5の素晴らしく詳細な画像が得られる。ここで、我々は遺伝的に汎用性の高いモデル動物、Cで中間代謝フラックスを評価するために、この高感度および特定の方法論を活用するための詳細なプロトコルを提供しているエレガンス 。下流の代謝物の同位体濃縮を測定する際に実際に、安定同位体標識された代謝前駆体（例えば、13 C -グルコースのような）で生きている動物を餌と中間代謝経路のフラックスに新たな洞察を可能にします。我々は、解糖、ピルビン酸代謝、およびトリカルボン酸サイクルを通じてフラックスの堅牢な分析を得るために信頼性の高い方法論を開発した。これは、初期の幼虫の発育段階から安定同位体を与えられた動物や有糸分裂後の成人期に始まる両方達成することができます。以前に無料のワームのアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびグルタミンの異なる種の絶対的な同位体濃縮を決定するために、4を説明するように別の代謝産物の種の同位体濃縮は、高速液体クロマトグラフィーにより全体ワーム遊離アミノ酸のプロファイリングと一緒に勉強することができます。 1,000〜2,000若い成人同期ワームのアリコートでアミノ酸と有機酸の分析物を測定する際に実際に、同位体濃縮の一貫したパ​​ターンが得られる。そのような方法論は、敏感に、野生型ワームへの相対核遺伝子ベースのミトコンドリア変異株では異常な中間フラックスを区別することができます。 このテクニックは、代謝の一般的な先天との関連性の特定の生化学的経路に磁束の変化を調査するために値を保持します。特に、安定同位体で標識されたグルコースの利用率は、ミトコンドリア病との関連性の中心的な代謝経路を介して炭素フラックスを通知します。確かに、私たちのデータではそのような方法論の適用は、敏感に、野生型ワームへの相対核遺伝子ベースのミトコンドリア複合体IIIのサブユニット変異株（ISP - 1（qm150））における異常な中間フラックスを識別することができます示唆している。 同位体の暴露が数日に一つの期間に完了するので、細胞ベースのモデルで決定される可能性があるので、定量同位体濃縮が定義された期間にわたって、&quot;定常状態&quot;濃縮値ではなく、定量化可能なフラックスを表していることを認識することが重要です。数分から数時間の間、同位体にさらされる。線虫の開発の過程で経路のフラックスを問い合わせるの別の潜在的な制限は、特定の変異株で発生する幼虫の発育の長さが異なるにも関する。例えば、多くの重篤なミトコンドリアの変異は、サード（L3）幼虫のステージ6で停止を引き起こすことが知られている。従って、唯一の成人期まで生存する動物の同位体の取り込みの分析は、全​​体の変異体集団を代表できない場合があります。しかし、この方法論は、特定の幼生期（例えばL2など）ではなく、動物が成体段階に到達するのを待つで中間代謝物の同位体の取り込みを評価するために適合させることができる。同様に、dauerとして知られている別の幼虫期に入る動物はおそらく大幅にfour幼生段階を経て直接進む動物に（可能性低い）代謝フラックスの相対的に変更している。今後の研究はまた、直接の異なる遺伝的背景のdauer段階の動物の同位体の取り込みを評価するために行うことができた。動物は若い成人の段階に達すると開始一定時間（ここで、24〜48時間）のための安定同位体に動物を公開すること（のようなプロトコールBで詳述）変数発達期間の影響を除去。 13 C -グルコースのみが解糖、ピルビン酸代謝およびトリカルボン酸サイクルのフラックスに問い合わせをしながら、他の同位体トレーサーは、潜在的に線虫への関心の他の経路を介して生化学的経路のフラックスを調べるために評価することができます。例えば、15 N -グリシンは、線虫におけるアミノ酸の代謝回転を評価するために利用される場合があります。 このアプローチのもう一つの潜在的な制限は、代謝物の検出感度のレベルです。我々の経験は500​​若い成人の線虫の最小が正常にここで採用さHPLCとGC / MS法によって同位体の取り込みを定量化するために必要な示唆している。我々はこれが単一のワームから代謝物の種に代謝物と同位体の取り込みの信頼性の高い定量を許可する可能性は低い予想がこのような超高性能液体クロマトグラフィー（UPLC）のような高感度、と手段の利用、研究動物の数のさらなる削減を許可することがあります。我々は確実にそれぞれの菌株で低濃度の代謝物を検出するために見つけたの実験あたり1,000の動物のワームの集団を、研究。しかし、そのようなGABAのようないくつかの代謝物が、、唯一の確実のために、線虫のより大きな集団で定量することができる1 × 10 6匹4。 要約すると、安定同位体のプロファイリングは、長い先天性代謝異常を研究するために利用されている非侵襲的で安全な（非放射性）アプローチを提供します。 C.にこの方法論の適用線虫は、個々の遺伝性疾患および/ ​​または薬理学的エージェントの暴露に起因する生体 、全体の動物のレベルで発生するリアルタイム、代謝の変化、 で調査するために新たな能力を提供します。

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>S. basal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 - page 59</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-8503</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>OP50 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocols A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>K12 E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>NGM agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Products INT</td>
<td>N81800-1000.0</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (universally labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-1396</td>
<td>Protocol A and C</td>
</tr>
<tr>
<td>13C glucose (1,6 labeled)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Isotope labs</td>
<td>CLM-2717</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>60% Perchloric acid (PCA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>MK2766500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>&epsilon;-aminocaproic acid (Internal Standard)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-2504</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>MTBSTFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270243</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Regis</td>
<td>270010</td>
<td>Protocol E</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>140-1441</td>
<td>Protocols A and B (organic acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>142-1441</td>
<td>Protocols A and B (amino acid extraction)</td>
</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S-8875</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8045</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>3N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>1N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol A</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1 N HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>320331</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N NH4OH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>30501</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>4N KOH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>484016</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Deionized water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Milli Q Biocel</td>
<td>ZMQA60F01</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Helium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>24001364</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIKON</td>
<td>NI MNA41000</td>
<td>Protocols A, B, and C</td>
</tr>
<tr>
<td>pH meter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>S68167</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Table top centrifuge - 5804R</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>05-400-93</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Incubated platform shaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New Brunswick</td>
<td>M1324-0004</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Mini LabRoller Rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>H-5500</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Pestles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749520-0090</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Drill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kontes</td>
<td>K749540-0000</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>1 L glass beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-539P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 L Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-368</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 mL Erlenmeyer Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-356</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6431</td>
<td>Protocols A, B, and C1,C2</td>
</tr>
<tr>
<td>10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VT6430</td>
<td>Protocol C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Blue top tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labco</td>
<td>438B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml conical plastic tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>14-959-49A</td>
<td>All protocols</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microfuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>02-681-320</td>
<td>Protocols A and B</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Medical</td>
<td>301025, 301029, 301031</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>25 gauge needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-253-131</td>
<td>Protocols C1 and C2</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BIO-RAD</td>
<td>731-1550</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14673-043</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>60mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>25373-085</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Optically transparent glass plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Made in Glass Shop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Reacti-Vap III Evaporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>18826</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>Cotton</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>14224-516</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>High Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>Protocol C1</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>01-213-18</td>
<td>Protocol B</td>
</tr>
<tr>
<td>Timer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>T-2504-5</td>
<td>Protocol C</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas-Ratio Mass Spectrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermophinigan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HP</td>
<td>5980/5971</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>6980N/5973N</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>
<tr>
<td>HPLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian</td>
<td>9010</td>
<td>Protocol D</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

stable isotopic profiling of intermediary metabolic flux in developing and adult stage caenorhabditis elegans

安定同位体のプロファイリングが長い遺伝子の突然変異および/または細胞と哺乳動物モデルにおける薬物療法の代謝の結果の敏感な調査を許可しています。ここで、我々は線虫、 線虫（Caenorhabditis elegans）での中間代謝と代謝フラックスの安定同位体のプロファイリングを実行するための詳細な方法について説明します。様々な薬理学的治療にさらされたままの方法は、ラベル付けされた二酸化炭素は、標識有機酸、および若年成人のような線虫の増殖培地の寒天プレートまたは最初にどちらかの初期の開発から安定同位体に暴露された動物で標識されたアミノ酸は、全体のワーム遊離アミノ酸をプロファイリングするために記載されています液体培養インチ遊離アミノ酸は、4％過塩素酸で抽出された全体のワームのアリコートで、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量化されています。普遍的に13 C -グルコースまたは1,6のラベル- 13 C 2 -グルコースは、そのラベルの付いた炭素、二酸化炭素の質量分析法（大気および溶存両方）と同様の解糖を介して磁束を示す代謝物がトレースされる安定同位体前駆体として利用されている、ピルビン酸代謝、およびトリカルボン酸サイクル。代表的な結果は、同位体の露光時間、様々な細菌の決済プロトコル、および野生型線虫、ならびにとしてミトコンドリア複合体III変異体のワームの同位体の取り込みの相対的な範囲（ISP - 1（qm150）の代替ワームの破砕方法の効果を示すために含まれて）野生型ワームからの相対。生きている線虫における安定同位体プロファイルのアプリケーションは、個々の疾患の遺伝的および/または薬物療法によって引き起こされる全体の動物のレベルのリアルタイム代謝の変化に調査するために新たな能力を提供します。

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Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

中間代謝フラックスのガスクロマトグラフィー質量分析による安定同位体のプロファイリングは、線虫で説明されています<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;。メソッドは、二酸化炭素、有機酸、および開発中の寒天プレート上または液体培養における成人期のどちらかの同位体曝露後のアミノ酸の同位体濃縮を評価するために詳しく説明されています。

開発と成人期における中間代謝フラックスの安定同位体プロファイル線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

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マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

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embryos, the genetic ...

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