Name: optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells at JoVE.com

وأيد هذا العمل من خلال اكتشاف المنحة التشغيل إلى JDS من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث (NSERC) في كندا ، والكسندر غراهام بيل كندا NSERC منح دراسات عليا (دكتوراه) (ألف لSENATORE) ومؤسسة القلب والسكتة الدماغية ، منحة على سبيل المعونة NA # 6284.

<html> 1. خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزرع الجنينية البشرية الكلى 293T الخلايا (كلوة الجنين البشري - 293T ، Invitrogen) في monolayers ملتصقة في تنفيس قوارير 2 25cm (زراعة الأنسجة المعالجة ؛ Cellstar ؛ غرينر الحيوي واحد) التي تحتوي على 6mL النسور Dulbecco ومتوسط?...

<ol>
	<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+(LCav3)+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis.">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li><li>Ogden, D., Stanfield, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+single+channel+and+whole-cell+recording.">Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording.</a> Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamping:+an+introductory+guide+to+patch+clamp+electrophysiology.">Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology.</a> , (2003).</li><li>Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2++current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2+channels.">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li></ol>

<html> أن تكون قادرة على تسجيل كامل الخلية التيارات باستخدام البروتوكولات وصفها والحلول يشير إلى أن ترنسفكأيشن كانت ناجحة وأن المطلوب قنوات ايون الجهد أو بوابات المجمعات قناة ايون موجودة بكميات كبيرة في غشاء الخلية. وينبغي transfected الخلايا بشكل إيجابي (أي الفلورية الخضر?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> مادة </td><td> شركة </td><td> رقم كتالوج </td><td> تعليق </td></tr><tr><td> pIRES2 - EGFP البلازميد </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> دائرة الزجاج coverslips </td><td> فيشر العلمية </td><td> 12-545-80 </td><td> دوائر رقم 1 -- 0.13 و 0.17mm سميكة ، الحجم : 12mm </td></tr><tr><td> مكبر الصوت </td><td> محوار الآلات </td><td> Axopatch 200B أو 700B Multiclamp </td><td></td></tr><tr><td> بيانات اقتناء نظام </td><td> محوار الآلات </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> الكهربية برامج </td><td> محوار الآلات </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> المتلاعبين ماصة </td><td> شركة سوتر الصك </td><td> MPC - 385-2 </td><td></td></tr><tr><td> مجهر مقلوب Epifluorescence </td><td> زايس كندا </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> محوار الآلات </td><td> CV - 7B </td><td></td></tr><tr><td> Headstage القطب حامل </td><td> محوار الآلات </td><td> 1 - HL - U </td><td></td></tr><tr><td> حامل Microelectrode الكهربائي عن الأرض </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> الأنابيب الشعرية الكهربية </td><td> شركة سوتر الصك </td><td> BF - 150 - 86 - 15 </td><td> البورسليكات الزجاج مع خيوط ، OD 1.5mm ، OD 0.86mm ، 15cm طويلة </td></tr><tr><td> لهب / براون Micropipette بولير </td><td> شركة سوتر الصك </td><td> P - 97 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette النار ملمع </td><td> Narishige </td><td> قهوة الدقيقة MF - 830 </td><td></td></tr><tr><td> النظام الجزئي المخدرات نضح </td><td> أتمتة العلمية </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> المخدرات نظام الارواء </td><td> أتمتة العلمية </td><td> Valvelink8.2 مع صمامات تفلون </td><td></td></tr></table>

optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells

والتعبير في المختبر وتسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات في خلايا الكلى البشرية المستزرعة الجنينية (كلوة الجنين البشري - 293T) هو استراتيجية للبحث في كل مكان. يجب أن تكون مطلية كلوة الجنين البشري على خلايا - 293T coverslips الزجاج في كثافة منخفضة بما فيه الكفاية بحيث أنها ليست على اتصال مع بعضها البعض من أجل السماح لتسجيل الآثار الكهربية دون التباس بسبب اتصال مع الخلايا المجاورة. ويجب أيضا أن أعرب عن Transfected قنوات ذات كفاءة عالية في غشاء البلازما لخلية كاملة التصحيح تسجيل المشبك التيارات كشف عن مستويات الضوضاء. القنوات الأيونية غيروي غالبا ما تتطلب فترات حضانة طويلة عند 28 درجة مئوية بعد ترنسفكأيشن من أجل تحقيق الكافي التعبير الغشاء ، ولكن هناك زيادة الخسائر في خلية التصاق ساترة والاستقرار في هذا الغشاء درجة الحرارة. للتحايل على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير استراتيجية الأمثل لخلايا كلوة الجنين البشري - 293T transfect واللوحة. هذا الأسلوب يتطلب أن تكون الخلايا في transfected confluency مرتفعة نسبيا ، وحضنت في 28 درجة مئوية لفترات متفاوتة الحضانة بعد ترنسفكأيشن كافية للسماح لقناة أيون بروتين تعبير. ومطلي ثم الخلايا Transfected coverslips على الزجاج والمحتضنة في 37 درجة مئوية لعدة ساعات ، والذي يسمح لمرفق خلية جامدة إلى coverslips وrestabilization الغشاء. يمكن تسجيل الخلايا بعد وقت قصير من الطلاء ، أو يمكن نقلها إلى 28 درجة مئوية لمدة حضانة أخرى. نجد أن الاحتضان الأولي في 28 درجة مئوية ، بعد ترنسفكأيشن لكن قبل الطلاء ، هو المفتاح للتعبير عن كفاءة قنوات ايون غيروي التي عادة لا تعبر جيدا في غشاء البلازما. transfected بشكل إيجابي ، ويتم تحديد الخلايا المستنبتة من خلال التعاون مع وأعرب eGFP أو eGFP أعرب من ناقلات bicistronic (على سبيل المثال ، pIRES2 EGFP) يحتوي على قناة أيون المؤتلف [كدنا] المنبع فقط من دخول موقع الريبوسوم الداخلية وتسلسل eGFP الترميز. خلية كاملة تسجيل المشبك التصحيح يتطلب معدات متخصصة ، بالإضافة إلى صياغة من الأقطاب الكهربائية تسجيل المصقول وأقطاب الأرض على شكل حرف L من الزجاج البورسليكات. لا يمكن أن يتحقق تسليم المخدرات لدراسة الصيدلة من القنوات الأيونية التي micropipetting مباشرة المخدرات في صحن التسجيل ، أو باستخدام نظم تدفق microperfusion أو الجاذبية التي تنتج تيارات غير منقطعة من المخدرات على حل الخلايا المسجلة.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells at JoVE.com

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

طريقة موثوقة ذات كفاءة عالية<em&gt; في المختبر</em&gt; التعبير وتسجيل الكهربية لاحقة من المؤتلف قنوات ايون الجهد بوابات في خلايا الكلى البشرية المستزرعة الجنينية (كلوة الجنين البشري - 293T).

الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

الكهربية طرق تسجيل الإمكانيات متشابك من يرقات ذبابة الفاكهة من NMJ

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

الحصاد وإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لتسجيل الكهربية وغيرها من الإجراءات

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

التعبير البروتين المؤتلف لعلم الأحياء الهيكلي في HEK 293F خلايا نظام التعليق: رواية ويمكن الوصول إليه المنهج

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

إعادة تشكيل البروتين عبر الغشاء، وايون القناة بوابات الجهد، KvAP، إلى العملاق Unilamellar الحويصلات للفحص المجهري وتصحيح الدراسات المشبك

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

متعددة الوظائف، طريقة Micropipette القائم لتأسيس وتحفيز القنوات Mechanosensitive البكتيرية ايون في القطرة واجهة طبقات ثنائية

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

ارتفاع العائد التعبير عن البروتينات المؤتلف الإنسان مع عابر ترنسفكأيشن من خلايا HEK293 في تعليق

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...