Name: optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells
Uploaded: 2011-01-19T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een Discovery exploitatiesubsidie ​​aan JDS van het Natural Science and Engineering Research Council (NSERC) van Canada, een NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Beurzen (doctoraal) (naar A. Senatore) en de Hart en Stroke Foundation, Grant -In-Aid NA # 6284.

<html> 1. Cel Cultuur <ol><li> Menselijke embryonale nier 293T-cellen (HEK-293T, Invitrogen) worden gekweekt in aanhanger monolagen in geventileerde 25cm 2 kolven (behandelde weefsel cultuur, Cellstar, Greiner Bio-One) met 6 ml van Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma Aldrich), aangevuld met 10 % v / v foetaal runder serum (FBS, Sigma Aldrich), 1% natrium pyruvaat, en 250 ug / ml penicilline / streptomycine bij 37 ° C met 5% CO 2). Cellen worden geïncubeerd in CO ...

<ol>
	<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Senatore, A., Spafford, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+big+are+key+features+of+an+invertebrate+T-type+channel+(LCav3)+from+the+central+nervous+system+of+Lymnaea+stagnalis.">Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).</li><li>Ogden, D., Stanfield, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+single+channel+and+whole-cell+recording.">Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording.</a> Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamping:+an+introductory+guide+to+patch+clamp+electrophysiology.">Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology.</a> , (2003).</li><li>Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+flow-induced+increase+in+inward+Ba2++current+expressed+in+HEK293+cells+transiently+transfected+with+human+neuronal+L-type+Ca2+channels.">Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels.</a> Brain Research. 1045, 116-123 (2005).</li></ol>

<html> In staat zijn om whole-cell stromen met behulp van de beschreven protocollen en oplossingen record geeft aan dat de transfectie succesvol was en dat het gewenste voltage-gated ion kanalen of ionkanaal complexen aanwezig zijn met aanzienlijke hoeveelheden op het celmembraan. Indien de cellen die positief worden getransfecteerd (dat wil zeggen fluorescerend groen) maar geen recordable stromingen, extra tijd bij 28 ° C kan nodig zijn om het kanaal eiwit goed worden verpakt en ingevoegd in de celmembraan. Merk op dat...

<table border="1"><tr><td> Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus Nummer </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> pIRES2-EGFP-plasmide </td><td> Clontech </td><td> 6029-1 </td><td></td></tr><tr><td> Cirkel dekglaasjes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-80 </td><td> Cirkels nr. 1 - 0,13 tot 0.17mm dik, Size: 12mm </td></tr><tr><td> Versterker </td><td> Axon Instruments </td><td> Axopatch 200B of 700B Multiclamp </td><td></td></tr><tr><td> Data Acquisition System </td><td> Axon Instruments </td><td> Digidata 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofysiologie Software </td><td> Axon Instruments </td><td> pClamp10.1 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet manipulatoren </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> MPC-385-2 </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescentie omkeermicroscoop </td><td> Zeiss Canada </td><td> Axiovert 40 CFL </td><td></td></tr><tr><td> Headstage </td><td> Axon Instruments </td><td> CV-7B </td><td></td></tr><tr><td> Headstage elektrode houder </td><td> Axon Instruments </td><td> 1-HL-U </td><td></td></tr><tr><td> Micro-elektrode houder voor aardelektrode </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> MEH3RF 15 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrofysiologie capillairen </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> BF-150-86-15 </td><td> Borosilicaatglas met een gloeidraad, OD 1.5mm, 0.86mm OD, 15cm lang </td></tr><tr><td> Flaming / Bruin Micropipet Puller </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipet brand polijstmachine </td><td> Narishige </td><td> Micro Forge MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-drug perfusie-systeem </td><td> AutoMate Wetenschappelijke </td><td> SmartSquirt8 Valvelink8.2 </td><td></td></tr><tr><td> Drugs perfusie-systeem </td><td> AutoMate Wetenschappelijke </td><td> Valvelink8.2 met Teflon kleppen </td><td></td></tr></table>

optimized transfection strategy for expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in hek-293t cells

De in vitro expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ionkanalen in gekweekte humane embryonale niercellen (HEK-293T) is een alomtegenwoordige onderzoeksstrategie. HEK-293T cellen moeten worden uitgeplaat op dekglaasjes bij laag genoeg dichtheid, zodat ze niet in contact met elkaar, om voor de elektrofysiologische opname mogelijk te maken zonder verstorende effecten als gevolg van contact met de aangrenzende cellen. Getransfecteerd kanalen moeten ook uitdrukken met een hoog rendement bij het plasmamembraan van whole-cell patch clamp-opname van aantoonbare stromen boven geluidsniveau. Heterologe ion kanalen vereisen vaak lange incubatieperiode bij 28 ° C na transfectie om adequate membraan expressie te bereiken, maar er zijn steeds meer verlies van cel-adhesie dekglaasje en membraan stabiliteit bij deze temperatuur. Om dit probleem te omzeilen, ontwikkelden we een optimale strategie om transfecteren en plaat HEK-293T cellen. Deze methode vereist dat de cellen worden getransfecteerd bij een relatief hoge confluentie, en geïncubeerd bij 28 ° C voor de verschillende incubatie periode post-transfectie zodat er passende ionkanaal eiwit expressie. Getransfecteerde cellen worden daarna uitgeplaat op dekglaasjes en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende enkele uren, die zorgt voor stijve cel gehechtheid aan de dekglaasjes en membraan restabilization. Cellen kunnen worden opgenomen kort na plateren, of kan worden overgedragen aan 28 ° C voor verdere incubatie. We vinden dat de eerste incubatie bij 28 ° C, na transfectie maar voor plating, is de sleutel voor de efficiënte expressie van heterologe ion kanalen die normaal gesproken niet goed te spreken over de plasmamembraan. Positief getransfecteerde, zijn gekweekte cellen geïdentificeerd door co-expressie eGFP of eGFP uiting van een bicistronische vector (bijv. pIRES2-EGFP) die de recombinante ionkanaal cDNA net stroomopwaarts van een interne ribosoom entry site en een eGFP coderende sequentie. Whole-cell patch clamp opname vereist gespecialiseerde apparatuur, plus het vervaardigen van gepolijste registrerende elektroden en L-vormige massa-elektroden van borosilicaatglas. Drug delivery van de farmacologie van ionen kanalen studie kan worden bereikt door direct micropipetting drugs in de opname gerecht, of door gebruik te maken microperfusion of zwaartekracht stroom systemen die een ononderbroken stromen van het geneesmiddel oplossing productie van meer dan opgenomen cellen.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells at JoVE.com

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

Betrouwbare methode voor zeer efficiënte<em&gt; In vitro</em&gt; Expressie en de daaropvolgende elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ionkanalen in gekweekte humane embryonale niercellen (HEK-293T).

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Oogsten en voorbereiden Drosophila Embryo&#39;s voor elektrofysiologische opname en andere procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Elektrofysiologische opname in de Drosophila Embryo

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Multifunctionele, Micropipet-gebaseerde methode voor opname en het stimuleren van bacteriële mechanosensitieve Ion Channels in Droplet Interface dubbellagen

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...